论文部分内容阅读
目的:在亚洲大湄公河次区域,疟疾是一个重大的公共卫生问题。近年来,加强了疟疾防治工作,使大多数国家的疟疾都得到了实质性的改善。但区域内仍有部分地区如缅甸,疫情不容忽视,而我国的云南省隶属于大湄公河次区域（Great Mekong Subregion,GMS）,输入性疟疾在所难免。疟疾流行的一个值得注意的变化是在大湄公河地区大多数地方病地区出现主要以间日疟原虫为主。由于间日疟关注相对较少,尽管其全球分布范围比恶性疟原虫大得多,而且由于复发性感染的长期发病率,对经济和公共卫生产生了惊人的影响。参与红细胞入侵的疟原虫裂殖子蛋白是由宿主免疫选择的,其多样性受疟疾流行病学变化的影响很大。在GMS地区,疟疾传播集中在国际边界,疟疾流行病学发生了重大变化,间日疟原虫已成为许多地区的优势种。在此,我们研究了GMS缅甸东部和西部边境间日疟原虫Duffy结合蛋白基因结构域II（PvDBP-Ⅱ）的遗传多样性,并与全球间日疟原虫种群进行了比较。此外,从GenBank中检索了世界9个间日疟原虫种群的504个PvDBP-Ⅱ序列,并对其遗传多样性、重组和群体结构进行了比较分析。重要的是,我们首次应用42 SNP条码对GMS地区的间日疟原虫（Plasmodium vivax,P.vivax）进行基因多态性以及种群结构分析,包括中国南部（盈江）,缅甸东北部、西部和南部（Laiza、Meomauk、Paletwa、Kyauktaw、Thanbyuzayat和Kawthaung）,泰国西部（Tak）地区,旨在明确GMS地区P.vivax的基因多态性和种群遗传特征,为进一步开展和强化疟疾防治策略提供理论基础。研究方法:1、通过PCR、克隆和测序获得中缅边境和缅甸西部共167个PvDBP-Ⅱ序列。利用GenBank数据库获得来自全球其它9个地区共504个PvDBP-Ⅱ序列,应用MEGA7.0、DnaSP 5.10.01、NETWORK v4.6.1.3、STURCTURE v2.3.4等软件对PvDBP-Ⅱ基因进行遗传多样性、自然选择、重组、连锁不平衡分析以及遗传分化、单倍型网络和群体遗传结构分析,并通过RONN服务器评估与B、T细胞表位相关的多态性分析和假定的本质非结构化/无序区域（IURS）。2、收集2011-2018年GMS地区间日疟感染患者的指尖血样本,采用MassARRAY技术对42 SNP条形码进行多重基因分型,应用GenAlEx,Haploview 4.1,STRUCTURE v2.3.4,ARLEQUIN v3.5,MEGA 7.0和在线程序ClustVis对GMS地区的间日疟原虫进行感染复杂性、遗传多样性、连锁不平衡、分子方差分析和Mental检验,以及主成分分析、遗传分化、种群结构等反应群体遗传特点的分析。结果:1、PvDBP-ⅡR391C突变是缅甸西部分离株的独特之处。2、在中缅边境和缅甸西部P.vivax核苷酸位置1078-1332bp之间鉴定了PvDBP-Ⅱ核苷酸多样性的最高峰;氨基酸水平上多态性的程度增强;结果表明,PvDBP-II的中心区域比其他区域更具有多态性。3、通过Fu和Li’s F*检验和Tajima’D分析中缅边境分离株PvDBP-II基因检测阳性选择（P<0.05）,说明本地区的P.vivax种群处于压力正选择。4、LD分析显示,R2值在缅甸西部P.vivax群体中下降得更快,表明缅甸西部寄生虫数量更大,基因内重组水平更高。5、中缅边境与缅甸西部的P.vivax群体分化程度低,与哥伦比亚遗传分化程度较高（FST分别为:0.32753和0.38761）,而与全球其他地区P.vivax群体之间的遗传分化程度较低（Fst:0.02760～0.21909）。6、种群结构及聚类分析显示,GMS地区的P.vivax群体的分为三个亚类,并显示了高度的基因混合;在210个GMS地区间日疟原虫的PvDBP-II序列中,共鉴定出60个独特的单倍型,其中65%的单倍型单独出现;而且在GMS各流行区具有共享单倍型,说明存在基因交流。7、所有预测的B细胞和T细胞表位和MHC结合区均呈多态,且Tajima’D值均为阳性,表明种群规模和平衡选择有所减少,可能与PvDBP-II的多样性有关。8、SNP条形码分析GMS地区的间日疟原虫中,158株（53.7%）含有多重感染,且在各流行区间存在显著差异,说明间日疟在GMS各流行区的负荷有所不同。9、在间日疟原虫基因组的14条染色体上的42个SNPs中,37个SNPs的AMAF值均大于0.1（表2.4）,结果表明GMS地区的间日疟原虫种群多样化程度较高。10、SHDI还是He观察结果,均反应出本研究中GMS各地区间日疟原虫的遗传多样性没有明显差异。11、不论是基于IAM还是SMM模型,缅甸南部的Ne最高,其次是缅甸西部,东北部和泰国西部（表2.5）,而整体的有效群体数量差别不大。12、LD分析显示,除缅甸东北部Meomauk镇的间日疟群体大部分SNP组合的R2大于0.3外,其余均小于0.3;不论群体划分的大小,LD系数R2会随着遗传距离的增加而缓慢下降。经过多次比较校正后,R2值与北京LD水平无显著性差异。13、STRUCTURE结果显示,8个群体主要聚为两个亚群;其中,缅甸东北部的Laiza镇间日疟种群以绿色亚群为主,而Meomauk镇的两种亚群分布较均匀,而其他流行区均以红色亚群为主,结果提示缅甸东北部流行区间日疟主要单倍型不同于其它流行区,而其它流行区具有相似的P.vivax单倍型遗传模式。14、分子变异（AMOVA）分析表明,GMS范围内的间日疟原虫的遗传变异13%来自于种群间,而87%的遗传变异归因于种群内部;GMS范围内,部分地区之间显示出中等程度的遗传分化（Fst:0.06～0.07）、而部分地区显示出极低的遗传分化（Fst0.02～0.03）;结合分子变异模型AMOVA分析与Fst结果,表明间日疟原虫在GMS区域的这8个地理种群的遗传分化主要来自于种群内部。对全球间日疟原虫的遗传分化的Fst分析结果显示,GMS和南美洲、非洲和南亚间日疟种群之间的分化程度均较高（Fst:0.40～0.52）,表明SNPs条形码标记的间日疟原虫在全球范围的种群间存在着不同程度上的遗传分化。15、PCA分析显示,筛选的38 SNPs条形码标记的P.vivax在GMS各群体间并有明显的聚类,无法区分GMS地区的P.vivax种群;而在全球SNPs标记数据中,GMS以其地理位置为中心聚集为一簇,只有少部分交叉于其它地区的间日疟群体中16、系统发育树分析发现与PCA结果相一致,GMS地区P.vivax种群明显聚类,亲缘关系很近;南美洲的间日疟原虫较早的单独为一簇,表现出于其它居群较远的亲缘关系;虽然非洲和南美洲在分支末端各自聚为一支,但二者相较于南美洲,表现出与GMS居群更近的亲缘关系。结论:1、PvDBP-II基因在中缅边境和缅甸西部P.vivax种群中表现出遗传多样性,与全球种群相当。2、PvDBP-II基因出现阳性自然选择和重组,以及T、B细胞表位和MHC结合区均呈多态,提示中缅边境和缅甸西部P.vivax可能处于宿主免疫压力的选择。3、PvDBP-II基因在中缅边境和缅甸西部表现轻微基因分化,表明P.vivax在这两个地区发生基因流动。4、SNPs条形码标记的GMS地区的间日疟群体具有较高的种群内多样性。5、SNPs条形码无法区分GMS地区的间日疟群体,但可区分亚热带和热带地区的间日疟原虫种群。6、建立了基于SNPs条形码的GMS地区P.vivax基因型数据库,为进一步开展间日疟原虫溯源的分子流行病学研究提供理论基础。