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背景Wnt信号通路的激活在慢性肾脏疾病(CKD)的发展中发挥重要作用,但其作用机制目前仍知之甚少,该研究旨在探讨CKD患者中广泛存在的肾脏Wnt9a表达上调通过何种机制促进肾纤维化进展。方法通过蛋白免疫印迹(WB)及免疫组织化学(IHC)法检测CKD患者及多种肾损伤动物模型肾脏中Wnt9a的表达变化。在CKD患者及阿霉素肾病(ADR)小鼠模型的肾脏连续切片中检测Wnt9a与细胞衰老标志蛋白p16Ink4a的共定位情况。在小鼠单侧缺血再灌注损伤(UIRI)模型中,通过尾静脉快速注射使携带Wnt9a编码基因或干扰序列的质粒载体进入肾脏中,实现体内上调或下调Wnt9a基因的表达。通过实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)、WB、IHC及组织免疫荧光(IF)法检测肾纤维化、肾小管上皮细胞衰老、损伤及肾脏功能学相关改变。使用2月龄及24月龄小鼠建立UIRI模型并经尾静脉注射抗衰老基因klotho(s-klotho)编码质粒抑制Wnt9a表达,进一步检验Wnt9a在衰老相关性肾纤维化中的作用。体外实验中,我们检测了过表达Wnt9a或Wnt9a细胞因子刺激的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)的细胞周期及衰老相关指标的表达变化。另一方面,应用马兜铃酸(AA)诱导HK-2细胞发生衰老样改变并通过Wnt9a小干扰RNA(siRNA)转染敲低被AA上调的Wnt9a表达,检测细胞周期及衰老相关蛋白的表达变化。Wnt9a介导的肾小管上皮细胞与成纤维细胞交互作用通过肾脏成纤维细胞系(NRK-49F)与HK-2进行验证。结果在多种CKD患者及动物模型肾脏中Wnt9a的表达均显著上调并主要定位于肾小管上皮细胞。通过对p16Ink4a,Kim-1,Klotho及fibronectin的检测,我们发现Wnt9a的表达增加与小管细胞衰老、损伤及肾纤维化相关。在UIRI模型中,外源性过表达Wnt9a加速了肾小管细胞的损伤和衰老,显著促进了肾纤维化的发展及肾功能的恶化。相反地,敲低肾脏Wnt9a表达则能够显著改善小管细胞的衰老与损伤,抑制肾纤维化,保护肾脏功能。相对于2月龄小鼠,缺血再灌注损伤诱导的肾脏Wnt9a表达在24月龄小鼠中更加显著,并且与肾纤维化的程度密切相关。体外实验中,我们发现过表达Wnt9a可诱导HK-2细胞系阻滞于S期内,伴随衰老相关蛋白p16Ink4a、ARF、RB、p53与P21的表达增加以及衰老相关的异染色质修饰γ-H2AX。通过使用β-catenin信号通路的小分子抑制剂ICG-001,我们证实了 Wnt9a主要通过活化β-catenin信号通路诱导肾小管上皮细胞衰老相关基因p53、p21以及TGF-β1表达。AA同样能够诱导细胞出现S期内阻滞及衰老样改变,而Wnt9a敲低显著改善了 AA诱导的S期内阻滞及衰老相关基因的表达。Wnt9a可诱导HK-2分泌TGF-β1,TGF-β1又可促进NRK-49F分泌Wnt9a,形成细胞间正反馈循环。HK-2来源的Wnt9a条件性培养基(Wnt9a CM)可显著促进NRK-49F增殖活化,该作用可被TGF-β受体Ⅱ的中和抗体部分阻断。来源于NRK-49F的Wnt9a CM则可进一步加剧小管上皮细胞衰老及EMT。结论以上结果提示Wnt9a通过诱导小管上皮细胞衰老加速了肾纤维化的发生和发展,靶向抑制Wnt9a表达可能成为改善肾脏疾病的一种新策略。