果蔬采后病害导致的巨大损耗已成为全球性问题，其中微生物侵染是造成腐烂的主要原因，由此造成的损失非常巨大。目前控制采后病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但其在果蔬中的残留毒性对人类健康有潜在危险，越来越受到全社会关注。此外，杀菌剂长期在某一地区使用会导致抗药菌株的产生，从而降低防治效果。因此，迫切需求寻找一些新的、无毒高效的防腐技术，以逐步取代化学杀菌剂在采后果蔬上的使用。　　 基因工程技术的迅速发展为解决上述问题提供了一条新途径，通过基因工程技术可改造原有基因，使之具有新的抗性，如利用构建工程菌，培育抗病品种。然而，此过程耗时且成本高，同时又很难对新变异真菌产生完全的抗性。目前，虽然有些生物具有良好控制活性的抗性基因已经被证明，但由于各种原因，包含抗性基因的商业产品尚很少见。植物几丁质酶能将真菌细胞壁的主要成分几丁质降解为几丁质单糖，破坏其细胞壁的骨架，可以使大多数病害真菌丧失侵染能力和致病能力，所以在植物抗病性方面具有重要作用。几丁质酶的抗病性活性已在水稻、油菜、烟草等多种作物中得到证实，但在果蔬采后贮藏保鲜领域内的研究尚未见报道。本课题利用DNA重组技术将几丁质酶基因整合到毕赤酵母菌基因组中，筛选高表达的基因工程菌株，分离纯化出几丁质酶，针对果蔬贮藏中常见的灰霉、根霉和链格孢等病原真菌，研究其作用效果及其体外作用机理，以寻求生物制剂用于果蔬保鲜的新途径。　　 本研究将来源于水稻的几丁质酶基因片段成功地导入毕赤酵母工程菌株GS115中，构建了多种GS115/pPIC9-Chi和GS115/pPIC9k-Chi转化的工程菌，并从多个工程菌株中筛选得到了一株几丁质酶表达量和酶活较高的工程菌株（NB01）。用该菌株摇瓶条件下培养，证明其诱导产酶的最佳条件为pH6.0，甲醇浓度1％，温度30℃，硫酸铵浓度为0.5％，油酸浓度为0.05％，诱导时间108h。在该条件下，平均蛋白表达量达171.99㎎/L，几丁质酶酶活为49.58 U/mL。　　 发酵罐高密度发酵结果表明，外源蛋白几丁质酶的表达量达到1544㎎/L，是摇瓶诱导表达量的8.98倍，几丁质酶酶活达230 U/mL，是摇瓶诱导酶活的4.64倍。高效表达几丁质酶重组毕赤酵母（NB01）的构建成功，为后续几丁质酶的性质、抑菌效果及抑菌机理的研究奠定了基础。　　 利用中空纤维超滤膜对发酵液进行浓缩、提纯，再经过Sephadex G-100柱层析后得到单一组分的重组几丁质酶，最终几丁质酶的纯化倍数为7.9961，几丁质酶酶活回收率达44.5％。　　 在对重组几丁质酶的理化性质进行了研究，结果表明在pH2-6范围内该酶活比较稳定，保温3 h后，几丁质酶的剩余活力仍在50％以上；65℃下保温1 h，酶活保持42.1％；几丁质酶在4℃环境中具有较好的贮藏稳定性，第8 d时其剩余酶活力仍有56.2％。金属离子Ag+、pb2+、Hg2+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Zn2+表现出强烈的抑制作用；而Mn2+、Fe2+、Ca2+、Na+对几丁质酶活性影响不大；K+、Mg2+对几丁质酶则有激活作用。　　 采用重组几丁质酶进行体外抑菌试验，结果表明，该酶对根霉、灰霉、链格孢霉等九种病原菌的菌丝生长均表现不同程度的抑制作用，证明其对病原真菌的抑制作用具有选择性。本研究通过扫描电镜（SEM）分析了四种病原真菌菌丝中几丁质的分布状况，并通过傅立叶中红外分析仪（FTIR）测定了菌丝中各个化学键的吸收峰（4000-500㎝-1），并对几丁质特征化学键酰氨（C=NH）吸收峰（1650±5㎝-1）进行基线矫正和积分，初步证明几丁质酶对病原真菌的体外抑制效果选择性产生原因可能与病原真菌细胞壁的表面结构和几丁质的百分含量直接相关。　　 本研究还对重组几丁质酶在果蔬保鲜上的应用进行了初步尝试。将纯化的重组几丁质酶施于已接种灰霉孢子悬浮液的葡萄、枇杷伤口处，观察病斑直径的变化情况，并通过果实内部各种酶活性的变化，探讨几丁质酶的诱导抗病机理。结果表明，几丁质酶处理能诱导采后葡萄的抗性，不仅使葡萄果肉中POD、PPO和PAL酶活性的增加，而且诱导果皮中酚类物质含量的增加，在不同程度上延缓葡萄、枇杷采后的发病时间，降低发病率和病斑直径。在贮藏初期，重组几丁质酶能够有效地控制发病率和病斑直径。但随着时间的延长，这种抑制作用逐渐降低。表明几丁质酶只能在一定时期内抑制果实组织中灰霉菌孢子的萌发和新生菌丝的生长，但不能杀死孢子及降解已经萌发的菌丝。可能是与几丁质酶的活性保存时间及果实组织内的反应环境有关，其详细机制还有待于今后进一步研究。　　 本研究为重组几丁质酶生物制剂的研发提供了实验依据和理论支持，并为果实生物防治及重组几丁质酶复合保鲜剂在果蔬生物保鲜上的规模化应用奠定了基础。