睡眠对机体而言,如同水、空气、食物一样重要。睡眠不仅能消除疲劳、储存体力,保护大脑、稳定情绪,增强免疫、康复机体,促进生长发育,睡眠还参与记忆过程。足够的睡眠是人获得最佳记忆、敏捷思维的保证。目前,生理性睡眠觉醒的调节机制不明,临床失眠症的预防和治疗也缺乏有效对策。伏隔核(nucleus accumbens, Acb)是腹侧纹状体的重要核团,由围绕前连合的核区和核区周围的壳区两部分组成。伏隔核内含有大量的腺苷A2A受体(A2AR),参与奖赏、成瘾和疼痛的功能调控。近年研究发现,伏隔核A2AR与睡眠-觉醒的调控以及睡眠障碍密切相关,一种受体所引发的行为功能,是由这种受体的载体神经元及其相关神经通路的作用结果。然而,关于伏隔核A2AR神经元的传出联系目前尚不明确。为什么要解析伏隔核A2AR神经元对睡眠—觉醒调控的神经通路?解析该神经通路将有利于揭示伏隔核中A2AR对睡眠—觉醒的调控机制,完善和补充生理性睡眠调节的理论和形态学依据；有利于为探索临床失眠病因、发病机制及干预措施提供神经解剖学基础。目前,关于伏隔核神经元投射资料均来自传统追踪技术(如HRP逆行追踪法、BDA顺行追踪和荧光素追踪法等)的解剖学观察；遗憾的是,因传统神经追踪术不能特异性地解析特定功能的神经通路,因此,伏隔核中A2AR是通过哪些神经通路发挥生理和病理生理性功能?目前仍不明确。已知脑内存在睡眠和觉醒两大调节系统,分别由众多的神经核团和递质(调质)组成。觉醒系统包括：脑干网状结构、蓝斑核去甲肾上腺素能神经元、中脑多巴胺能神经元、中缝背核5-羟色胺能神经元、背外侧被盖核/脚桥被盖核、脑桥-中脑和基底前脑乙酰胆碱能神经元、基底前脑非乙酰胆碱能神经元、下丘脑后部结节乳头核组胺能神经元及下丘脑外侧食欲素能神经元等。睡眠促进系统包括：下丘脑腹外侧视前区、基底神经节、大脑皮层、边缘系统、基底前脑及视前区GABA能神经元、脑干及丘脑的GABA能神经元等。因此,伏隔核中A2AR通过上述系统中的那哪些脑区而发挥调节作用尚待明确。食欲素(orexin)神经元主要位于下丘脑,Orexin神经元发出纤维密集地投向睡眠-觉醒相关的脑区。研究表明中枢orexin系统对觉醒起关键作用：小鼠orexin基因敲除或其受体基因自发突变后导致猝倒或病态快速动眼睡眠等发作性睡病样表型,Orexin神经元不仅作为觉醒激动系统中的一个结构参与促觉醒作用,还通过对其他睡眠-觉醒系统的统一控制实现对睡眠-觉醒的调控,此外下丘脑与伏隔核之间的联合作用在饮食、运动和镇痛等方面发挥了重要调控作用。那么,伏隔核A2AR神经元与orexin神经元是否存在相互的联系呢?研究发现,伏隔核谷氨酸受体通过下丘脑的介导调控了饮食行为,并且orexin纤维末梢在中脑腹侧被盖和蓝斑可能同时释放orexin和谷氨酸能神经递质,那么在伏隔核orexin纤维末梢是否也包含了谷氨酸能神经递质呢?这些都是本课题期待解决的科学问题。针对这些问题,本课题集中研究伏隔核A2AR神经元的传出联系以及与orexin神经元之间的纤维联系,以探讨伏隔核A2AR调控睡眠-觉醒的神经通路。我们主要进行了以下二部分的工作。第一部分伏隔核A2A受体神经元的传出联系目的：运用条件表达人源绿色荧光蛋白(humanized Renilla green fluorescent protein, hrGFP)的腺相关病毒(AAV-lox-Stop-hrGFP)结合A2A受体Cre小鼠特异性追踪伏隔核A2AR神经元的传出联系。方法：实验分为A2ACreR小鼠组和野生型小鼠组,用脑立体定位仪将病毒按一定坐标注入小鼠的伏隔核核区(AcbC, AP:+1.1 mm; ML:1.0 mm; DV:3.8mm)、内侧壳区(mAcbSh, AP:+0.98 mm; ML:0.5 mm; DV:4.0mm)和腹侧壳区(vAcbSh, AP:+1.10 mm; ML:1.0 mm; DV:5.0 mm).小鼠恢复4周后,进行全脑组织切片,切片厚30μm；运用hrGFP的免疫组织化学染色来显示注射部位A2AR神经元的表达及其轴突的投射。并运用hrGFP与γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid, GAB A)能标记蛋白GABA、hrGFP与GABA能投射神经元标记蛋白多巴胺和cAMP调节的磷蛋白(dopamine and adenosine 3’5’-monophosphate-regulated phosph o-protein, Mr 32 kD,DARPP32)和hrGFP与GABA能中间神经元标记蛋白小清蛋白(parvalbumin, PV)分别进行免疫荧光双标染色来证明伏隔核A2AR神经元的神经化学性质。结果：在A2ARCre小鼠组,伏隔核区有明显的hrGFP表达,而在野生型小鼠没有阳性表达。hrGFP日性细胞和突起几乎分布于整个伏隔核并向四周投射,阳性胞体直径大约10-15μm,形态大多为圆形或椭圆形。神经元的树突和轴突在核周质周围形成网状结构。免疫荧光双标染色结果显示：大多数的hrGFP与GABA共定位,进一步的实验发现hrGFP与DARPP32共表达而不与PV共表达,表明伏隔核腺苷A2AR神经元是GABA能投射神经元而非中间神经元。全脑连续切片的免疫荧光或DAB染色显示：伏隔核腺苷A2AR神经元的轴突投射至前脑、间脑和脑干。在前脑,伏隔核核区、伏隔核内侧壳区和伏隔核腹侧壳区的A2AR神经元轴突都分布于腹侧苍白球、斜角带核和无名质；或轴突的投射分布于下丘脑外侧区和视前外侧区；在脑干,以上亚区都有纤维或轴突投射至腹侧被盖区,而伏隔核核区和伏隔核腹侧壳区也投射至内侧中缝核、背侧中缝核和导水管周围腹外侧灰质区。结论：伏隔核A2AR神经元纤维或轴突投射至上述脑区或核团,可能与这些脑区或核团的神经元形成抑制性突触,从而发挥相应作用。以上结果为理解伏隔核A2AR和A2AR神经元的作用,尤其是其对睡眠的调控机制提供了重要的形态学基础。第二部分伏隔核A2A受体神经元与orexin神经元之间的神经环路目的：揭示伏隔核A2AR神经元与orexin神经元间的神经环路。方法：将条件表达人源绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV-lox-Stop-hrGFP)注入A2AR Cre小鼠的伏隔核(AP:+1.1 mm; ML:1.0 mm; DV:4.8 mm)采用hrGFP的免疫组织化学染色显示注射部位A2AR神经元的表达及其轴突在下丘脑结节区的投射；运用酶免疫细胞化学双重染色和免疫荧光双标染色观察伏隔核A2AR神经元的纤维末梢或轴突是否支配下丘脑外侧区结节区orexin神经元和orexin;神经元的纤维末梢或轴突是否支配伏隔核A2AR神经元；激光共聚焦检测orexin末梢在伏隔核可能释放的神经递质的性质；最后采用免疫电镜检测orexin末梢或轴突在伏隔核内的突触联系。结果：大量hrGFP阳性神经元在伏隔核表达并发出纤维末梢或轴突投射至下丘脑外侧区结节区,伏隔核A2R神经元的纤维末梢或轴突投射终止于下丘脑外侧区结节区orexin神经元胞体及其邻近的突起,同时orexin神经元的纤维末梢或轴突也终止于伏隔核γ-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, GAB A)能投射神经元和A2AR神经元的胞体和突起；并且在伏隔核内orexin神经元纤维末梢或轴突包含了谷氨酸囊泡膜转运体(vesicular glutamate transporter 2, VGLuT2)和突触素(synaptophysin, Syp),而不包含GABA能囊泡膜转运体(vesicular GABA transporter, VGAT)。免疫电镜检测发现orexin神经元纤维末梢或轴突在伏隔核区形成了兴奋性突触联系。结论：伏隔核A2AR神经元与orexin神经元之间存在纤维的往返联系。我们的结果提示这种纤维的往返联系和orexin末梢包含谷氨酸神经递质可能在伏隔核A2AR和orexin神经元联合调控睡眠-觉醒等功能方面发挥了重要作用。综上所述,伏隔核核区、内侧壳区和腹侧壳区的A2AR神经元纤维投射至脑的不同觉醒相关区域,这些区域可能正是伏隔核各亚区调节睡眠-觉醒的不同神经通路所在；伏隔核A2AR神经元与orexin神经元间在形态学上存在相互的纤维联系,并且orexin纤维末梢在伏隔核除释放Orexin中经递质外,也可能释放谷氨酸能神经递质。本研究结果为理解伏隔核A2AR和A2AR神经元的作用尤其是调控睡眠方面提供了坚实的形态学基础。