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细小病毒是严重危害养猪业的重要病毒。经典的猪细小病毒主要引起猪繁殖障碍。但随着现代病毒学研究技术的快速发展,新的猪细小病毒被不断发现,尤其是最近两年发现的猪Hokovirus(PHoV)和猪博卡样病毒(Porcine Boca-likevirus),引起了兽医科研工作者的极大兴趣。对于猪Hokovirus,目前仅有少数几个国家或地区的流行病学资料以及不足10株病毒的全基因组序列,猪Hokovirus在我国的流行情况如何以及该病毒的遗传变异等也不是很清楚；而对于猪博卡样病毒,目前国际上还没有全基因组序列的报告,该病毒是否属于博卡病毒尚需从全基因组水平上进一步的证实。为了从全基因组水平确定猪博卡样病毒的分类,同时调查我国猪Hokovirus和猪博卡样病毒的流行情况,本研究从PCR诊断方法的建立、流行病学调查和基因组序列分析等方面开展了研究,具体内容如下:
1.PHoV诊断方法的建立、分子流行病学调查和基因组序列分析
参考猪Hokovirus(PHoV)HK7株(GenBank accession number EU200677)的基因组序列,设计了一对扩增PHoV VP1基因的保守区域352bp片段的特异性引物,建立了检测PHoV的PCR诊断方法。试验证实该方法特异性良好,敏感性高,重复性良好。用建立的PCR检测方法对华中地区PHoV的流行情况进行了调查,结果显示所检测的454份样品中有123份为PHoV阳性,阳性率达27.09％。
设计涵盖PHoV基因组编码区的7对引物,分7段扩增获得了广西(GX株)、湖北(HB株)、湖南(HN株)的3份阳性样品的全基因组序列片段。利用Seqman软件将全部序列进行拼接,组成PHoV GX株、PHoV HB株、PHoV HN株的全基因组序列。结果表明:PHoV GX株、PHoV HB株和PHoV HN株基因组全长分别为5080nt、5080nt和5084nt。与国际参考毒株HK7株相比,3株国内分离株的编码区均不存在碱基的插入与缺失,但PHoV HN株在ORF1至ORF2处的非编码区存在4个碱基的插入或缺失。PHoV GX株,PHoV HB株和PHoV HN株和其它的猪Hokovirus参考株的系统进化树分析结果显示,PHoV的系统进化树形成两个分支,我国的PHoV流行毒株序列在一个分支上,而与德国分离株关系相对较远。对不同PHoV毒株之间的NS1基因核苷酸序列分析结果显示:核苷酸同源性为97.2％～100％,氨基酸同源性为97.8％～100％。对PHoV之间的VP1/2基因核苷酸序列分析结果显示:核苷酸同源性为98.1％～99.7％,氨基酸同源性为99.1％～100％。以上结果表明PHoV NS1和VP1/2基因均具有高度的保守性,且VP1/2基因的保守性稍高于NS1基因。
2.PBoV诊断方法的建立、分子流行病学调查和基因组序列分析
参考国际上报道的猪博卡样病毒的部分序列和检测方法,设计了一对针对猪博卡样病毒保守序列的PCR引物。该引物能特异性扩增496 bp的DNA片段。利用建立的猪博卡样病毒的PCR检测方法,对从华中地区采集的466份样品进行了检测,结果显示199份为阳性,阳性率高达42.7％,表明华中地区猪博卡样病毒的感染率相当高,应该引起养猪业的重视。
由于目前尚无猪博卡样病毒的全基因组序列报道,本研究通过设计简并引物并采用重叠延伸法,分4段获得了猪博卡样病毒WH1株的完整编码区序列。序列分析结果显示:猪博卡样病毒WH1株的序列长为4786bp(GenBankaccession number HQ223038)。与其它已知的博卡病毒,包括人博卡病毒(HBoV)、猩猩博卡病毒(GBoV)、牛细小病毒(BPV)和犬微小病毒(CnMV)的同源性分别为44％-48％(HBoV)、50％(GBoV)、44％-45％(BPV)、52％-55％(CnMV)。系统进化树分析表明:猪博卡样病毒与CnMV、BPV、GBoV和HBoV等博卡病毒有着共同的进化起源,而且猪博卡样病毒与CnMV遗传距离最近,处于同一系统进化树分支内。根据猪博卡样病毒的全基因组序列和进化分析,证实WH1株为猪博卡病毒(PBoV)。
利用GENSCAN软件对PBoV基因组DNA结构进行分析,发现PBoV的基因组由三个开放性阅读框ORF组成,ORF1编码非结构蛋白NS1,ORF2编码结构蛋白VP1/VP2,ORF1与ORF2之间的ORF3编码博卡病毒特有的NP1蛋白。PBoV NS1基因结构与HBoV NS1基因结构类似,都含有比较保守的选择性剪切和拼接位点,推测PBoV在宿主细胞内可能会表达两种NS蛋白。