论文部分内容阅读
胃癌是全世界较常见的一种恶性肿瘤,其发病率和死亡率较高,严重威胁着人类的生命健康。胃癌的致病因素及发病机制较复杂,遗传因素、环境因素、幽门螺杆菌感染以及不良的生活饮食习惯是导致胃癌发生的主要因素。尽管胃癌患者的诊断及治疗取得了较大的进展,但胃癌患者的整体生存率仍然较低,预后也较差。因此,了解和探究胃癌的致病机理和分子机制对于胃癌患者的治疗是非常重要的。G9a,也被称作常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2）,其含有SET结构域,是Suv39h蛋白家族的主要成员之一。G9a在生物体发育,维持干细胞干性,细胞分化以及肿瘤发生发展等过程中都发挥着十分重要的作用。G9a不仅可以通过富集在基因启动子上来抑制或增强基因的转录,同时它还可以作为脚手架蛋白招募一些转录因子去共同调节下游基因的表达。已有大量研究表明,G9a在肝癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达,且在促进细胞增殖和肿瘤发展过程中均发挥着非常重要的作用。虽然G9a在胃癌细胞中的作用已经有少数文献报道,但是其在调节胃癌细胞增殖、迁移和侵袭过程中的生物学功能以及相关的分子机制尚不明确。因此,本研究主要探究G9a在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭过程中所发挥的作用以及相关的分子机制,丰富该疾病的理论研究基础,同时为胃癌的临床诊断以及治疗提供一个新的思路。以下是本文的主要研究结果:1.G9a在胃癌中呈现高表达并且可能与胃癌患者的预后相关首先我们通过Oncomine数据库和TCGA数据库对G9a的表达情况以及G9a与胃癌患者预后关系进行了数据分析,结果显示与正常样本相比,G9a在胃癌样本中呈现出高表达。Kaplan–Meier生存分析表明,当G9a呈现高表达时,胃癌患者的整体生存率较低,由此预示着G9a的高表达可能与胃癌患者的预后不良是相关的。我们还通过Western Blot实验检测到G9a在胃癌细胞系中也是呈现高表达的。因此,在胃癌中G9a扮演的很有可能是一个致癌基因的角色。2.G9a影响胃癌细胞的增殖与成瘤能力为了探究G9a在胃癌细胞中的功能及作用,我们首先通过慢病毒介导的sh RNA干涉技术对胃癌细胞系中G9a的蛋白表达水平进行了下调。MTT实验和平板克隆形成实验均表明下调G9a后胃癌细胞的增殖及克隆能力明显减弱。随后我们通过细胞流式实验检测了G9a下调后胃癌细胞周期进程的变化情况。实验结果显示,G9a表达量下调后胃癌细胞的细胞周期被主要阻滞在了G2/M期并且G2/M期的相关蛋白的表达量发生了下调。最后我们通过Soft agar实验和建立NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型探究G9a表达量下调后对胃癌细胞体外和体内成瘤能力的影响。实验结果表明,G9a表达量下调后胃癌细胞的体外和体内成瘤能力明显受到抑制。上述实验结果表明组蛋白甲基转移酶G9a促进胃癌细胞的增殖及成瘤。3.G9a影响胃癌细胞的迁移与侵袭能力为了探究下调G9a后是否会影响胃癌细胞的迁移及侵袭能力,首先我们进行了细胞划痕实验,结果显示下调G9a后胃癌细胞的迁移能力明显减弱。接着我们进行了Transwell实验,结果再次表明下调G9a后胃癌细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。最后我们通过Western blot实验检测了下调G9a后胃癌细胞中与迁移侵袭相关的蛋白的表达情况,结果显示下调G9a后胃癌细胞中迁移侵袭相关的蛋白表达量发生了明显的变化。上述实验结果表明组蛋白甲基转移酶G9a促进胃癌细胞的迁移及侵袭。4.G9a特异性抑制剂BIX-01294影响胃癌细胞增殖及迁移侵袭能力为了探究BIX-01294抑制剂是否影响胃癌细胞增殖及迁移侵袭能力,我们首先进行了MTT实验和平板克隆形成实验,结果表明用BIX-01294抑制剂处理后胃癌细胞的增殖及克隆能力明显减弱。接着我们进行了细胞划痕实验和Transwell实验,结果显示用BIX-01294抑制剂处理后胃癌细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。最后我们通过Western blot实验检测了用BIX-01294抑制剂处理后胃癌细胞中与迁移侵袭相关的蛋白的表达情况,结果显示细胞中迁移侵袭相关的蛋白表达量发生了明显的变化。上述实验结果表明BIX-01294抑制剂抑制胃癌细胞的增殖及迁移侵袭。5.G9a通过促进Slug的转录来调控胃癌细胞的迁移及侵袭最后我们对G9a调控胃癌细胞迁移与侵袭的分子机制进行了探究。Slug是肿瘤细胞迁移与侵袭过程中一个重要的转录因子,同时近年来也有研究发现Slug也调控肿瘤细胞的增殖过程。而通过上述研究表明,下调G9a后胃癌细胞中Slug的m RNA水平和蛋白水平都明显降低。因此我们首先在G9a表达量下调的胃癌细胞中分别过表达G9a及Slug。然后我们通过MTT实验和Transwell实验发现,过表达G9a和Slug都能使胃癌细胞的增殖与迁移侵袭得到挽救。数据库分析也发现G9a与Slug的表达量呈正相关。为了进一步探究在胃癌细胞中G9a调控Slug表达的分子机制,我们进行了双荧光素酶报告基因实验。结果表明,下调G9a后可以使Slug启动子的活性明显降低。为了验证G9a是否通过与Slug启动子结合来促进Slug的表达,我们进行了染色质免疫沉淀（Ch IP）实验以确定G9a结合在Slug启动子上具体哪个位置。结果表明,G9a主要富集在Slug启动子上的-1065bp至-912bp的位置。这些数据表明G9a可以通过促进Slug的转录来调控胃癌细胞的迁移及侵袭过程。