耐热果胶酸裂解酶编码基因pel9A的克隆与表达

来源 :江南大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:faith661
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
果胶酸裂解酶可用于香料油和类胡萝卜素等医用原料的提取,咖啡和茶的发酵,含有果胶质废水的处理以及原油的提取过程。近年来又发现了果胶酸裂解酶还可用于植物病毒的纯化、纸浆漂白和以纺织品的生物精炼等。 利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌Clostridiumstercorarium中扩增得到产耐热果胶酸裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,构建表达型重组质粒pPel9A。将此重组质粒转化到受体菌EcoliBL21中进行表达,经37℃培养2h,在0.8mmol/L的IPTG存在下,于37℃诱导5h,经SDS-PAGE分析表达的蛋白质的分子量为130kDa,与预期分子量相符。细胞经超声破碎,测的果胶酶的比酶活为15U/mg粗蛋白。对质粒稳定性的研究表明,EcoliBL21(pPe19A)在无选择压的情况下37℃连续转接5次,质粒丢失率仅为15%,说明质粒基本稳定。 通过单因素和正交试验,优化得到用于培养重组菌E.coliBL21(pPel9A)产酶培养基组成为葡萄糖10g/L,硫酸铵2g/L,蛋白胨2g/L,柠檬酸1.0g/L,磷酸二氢钾12.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L,氯化钠2g/L,TES5mL/L,pH为7.0。经优化后,摇瓶培养得到菌体量为2.696g/L(DCW)。在5L台式搅拌发酵罐中,研究了补加碳源对重组菌生长的影响。控制溶氧在30%以上,初始葡糖糖10g/L,在对数生长期补加10g/L的葡萄糖,培养至8h,菌体量达到6.388g/L(DCW),果胶酸裂解酶活性为35U/mL培养液。 粗酶液经HiTrapChelatingHP镍亲合柱和Supedex200凝胶柱进行了纯化。对部分纯化的耐热果胶酸裂解酶的酶学性质研究表明,其最适pH为7.0,将酶液在不同pH缓冲液中于4℃处理12小时后测定的酶活表明其在pH5~9范围内稳定,酶的最适温度为65℃,温度稳定范围为40~75℃。不同的金属离子对酶活的影响不同,Fe2+能完全抑制酶的活性,Mg2+、K+、Co2+、Ni2+和Na+对酶活有不同程度的抑制作用,Ca2+在0.01~0.2mmol/L的范围内对酶有明显的激活作用,最高的激活浓度为0.05mmol/L。
其他文献
单引物PCR是一种只用一条引物就可以克隆已知序列侧翼未知区域的染色体步移方法。它利用引物在低严谨条件下会与模板发生错配结合的特性,使一端引物与已知序列退火,而另一端引物则与未知侧翼区的部分相似序列退火来实现完整的PCR扩增。为了研究引物的长短对扩增效率的影响,分别设计了三组长为6、8、10碱基的短引物以及一组19和22碱基的长引物,以甘蓝型油菜基因组DNA为模板进行单引物PCR扩增,用电泳检测扩增
国有企业集团管控体系建设是提升集团公司管理水平,提高运营效率,促进企业集团做大做强的有力保障.本文从国有企业集团母子公司关系出发,针对集团管控存在的突出问题,提出管
喜树小绿叶蝉是药用植物喜树的一种主要害虫,对喜树产业造成了严重危害,经鉴定为一新种,本研究首次系统报道了其生物学生态学及其防治: 1、2005年,在六枝喜树GAP林区,该虫只有一
白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种由多种细胞产生的具有复杂生物学功能的细胞因子,是至今发现的功能最为广泛的细胞因子之一,对免疫、造血、消化、内分泌、神经系统等具有