梅花鹿角脱盘蛋白多肽的分离纯化及活性研究

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鹿角脱盘是鹿科动物的角冠和残留的角根于翌年新茸萌发时自然脱落的部分,《中药大辞典》中把鹿角脱盘收录为中药材鹿角来源的一种,民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等。现代研究表明鹿角脱盘含有多种药理作用各异的活性成分,具有治疗乳腺增生、抑制乳腺癌、抗疲劳、镇痛、抑菌等多种功能,其显著的生理功能显示了很好的开发利用前景,因此开展鹿角脱盘这一珍贵动物性中药材资源的药效物质基础研究有一定的实际意义,同时促使相关资源为人类健康服务亦具有一定的参考价值。本实验采用生物化学方法分析梅花鹿角脱盘的化学成分并测定其含量。对于含量丰富的蛋白质,本研究采用酸提醇沉法从鹿角脱盘中提取活性总肽,利用SephadexG-50凝胶过滤层析和反相高效液相层析法对总肽进行纯化,确定每步分离纯化的活性组分。其中活性最高组分通过高效液相层析检测纯度,激光解析飞行时间质谱鉴定分子量,最终获得单体多肽。在此基础上,以小鼠乳腺癌细胞系MA782为体外研究对象,通过MTT法检测总肽和单体多肽对肿瘤细胞增殖的抑制情况;流式细胞仪检测对细胞周期的影响;TRAP-银染法检测细胞端粒酶活性的变化;相对荧光定量PCR法检测细胞端粒酶催化亚基TERT基因表达水平的变化。实验结果表明,梅花鹿角脱盘中含有16种氨基酸;粗蛋白和水溶性蛋白质含量分别为32.800%、12.800%;总糖、还原糖和可溶性糖含量分别为1.682%、0.575%和1.143%;粗脂肪、游离脂肪酸和磷脂含量分别为1.910%、0.067%和0.300%;鹿角脱盘中还含有钙、钾、锌、锰、铁、镁、钠等矿质元素。采用酸提醇沉法获得总肽,BCA法测得其蛋白质含量为91.800%。利用凝胶过滤层析和反相高效液相层析进一步分离纯化总肽,获得一纯度为98.800%,分子量为11.329kDa的单体多肽。MTT法检测结果显示总肽和单体多肽均能抑制MA782细胞增殖,其中作用72h后,总肽的抑制率为69.2%,单体多肽的抑制率为53.3%。流式细胞仪检测细胞周期结果表明总肽和单体多肽均能使大部分MA782细胞停滞在G0/G1期,其中总肽作用72h后G0/G1期细胞百分比为81.621%,S期细胞百分比为8.983%。单体多肽作用后G0/G1期细胞百分比为81.460%,S期细胞百分比为11.882%;改进的TRAP-银染法检测端粒酶的活性发现,与对照组比较,总肽和单体多肽均能使细胞端粒酶活性有所下降,且差异不显著;相对荧光定量PCR法差异分析结果显示,以对照组TERT表达水平为标准化1.000,总肽作用后TERT表达水平为0.031,单体多肽作用后TERT表达水平为0.088。上述实验结果说明鹿角脱盘总肽和单体多肽对小鼠乳腺癌细胞MA782的增殖均有较强的抑制作用,其中单体多肽可能是总肽中真正发挥抗肿瘤活性的重要组分之一。
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