背景肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是运动神经元病最常见的类型,临床上表现为上、下运动神经元的功能障碍。生存期短、治疗药物匮乏、疗效不佳是当前治疗ALS的主要困境,而研究ALS的发病机制将有助于学界寻找治疗突破点。ALS-12型的致病基因OPTN的表达产物——视神经蛋白（Optineurin,OPTN）参与了胞内多种生化代谢活动,如自噬、囊泡运输、NF-κB信号通路的激活等。我们前期实验中发现过表达与ALS相关的OPTN突变体（突变使OPTN功能减退）的小胶质细胞可引起运动神经元细胞活力下降,过表达野生型OPTN的小胶质细胞可引起运动神经元细胞活力升高。小胶质细胞是神经炎症的重要一员,目前研究者普遍认为其参与了 ALS的发病过程,小胶质细胞在疾病的极早期以促炎症的M1型为主,早期为起神经保护作用的M2型为主,而随着疾病的进一步进展,M1/M2比例失衡,M1型再次逐渐占优势,在疾病晚期以Ml型为主。因此,我们提出假说:OPTN功能减退可引起小胶质细胞向促炎的M1型极化并损伤运动神经元。本研究旨在验证该假说并为探究ALS-12型的致病基因OPTN的发病机制提供新思路。此外,既往研究提示NF-κB通路激活可使小胶质细胞向M1型转化,而OPTN参与了 NF-κB通路的激活,推测NF-κB通路在机制中起介导作用,在本研究中进一步探究了 OPTN通过NF-κB通路介导小胶质细胞M1型极化调控ALS发病的机制。方法1.将各OPTN突变型质粒（OPTNQ398X、OPTNE478G）、野生型OPTN质粒（OPTNWT）、OPTN siRNA转染入BV2细胞（小鼠来源的小胶质细胞系）以构建OPTN功能异常的小胶质细胞,与NSC-34细胞（小鼠来源的运动神经元细胞系）共培养并检测NSC-34细胞的细胞活力,初步探索小胶质细胞参与OPTN-ALS的发病过程。将OPTN siRNA转染入BV2细胞以敲除OPTN基因,并进行以下实验:2.利用实时荧光定量PCR、Western Blot、ELISA在mRNA水平、蛋白水平等层面检测细胞的M1/M2型表达水平,探究OPTN功能减退对小胶质细胞极化的影响。3.将细胞与NSC-34细胞共培养并利用免疫荧光流式细胞术检测NSC-34细胞的凋亡率,验证OPTN功能减退的小胶质细胞对运动神经元的损伤作用。4.利用免疫荧光技术、Western BLot、双荧光素酶基因报告系统检测p65（NF-κB转录复合因子亚基）的核定位、表达水平、转录活性,RT-PCR检测NF-κB信号通路下游产物TNF-α的mRNA水平以验证OPTN参与NF-κB信号通路的激活;利用NF-κB调节剂进行反证实验,检测小胶质细胞亚型标志物表达水平及共培养的NSC-34细胞的凋亡率,探究OPTN通过NF-kB通路介导小胶质细胞Ml型极化调控ALS发病的机制。结果1.OPTNQ398X、OPTNE478G、OPTN siRNA 组的 NSC-34 细胞的细胞活力下降,野生型OPTN组的NSC-34细胞的细胞活力升高,提示小胶质细胞在OPTN-ALS中的作用。2.OPTN基因敲除的小胶质细胞中M1型标志物MHC-Ⅱ、NOS-2表达增加,M2型标志物ARG-1、FIZZ1表达减少,IL-lβ、IL-6、NO、TNF-α等促炎因子分泌水平上升,IL-10、TGF-β等抑炎因子分泌水平下降,提示小胶质细胞向M1型极化。3.与OPTN基因敲除的BV-2-小胶质细胞共培养的NSC-34细胞凋亡率升高,提示OPTN功能减退的小胶质细胞可引起运动神经元的凋亡。4.OPTN基因敲除的BV-2-小胶质细胞中p65核转移增加、表达增加、转录活性升高,TNF-α的mRNA的表达增加,提示胞内NF-κB信号通路激活。加入NF-κB信号通路调节剂后,细胞亚型标志物表达水平及共培养的NSC-34细胞凋亡率变化,提示NF-κB信号通路发挥介导作用。结论ALS-12型的致病基因OPTN的表达产物OPTN的功能减退可致体外培养小胶质细胞向M1型极化,并促使共培养的运动神经元发生炎性损伤,该作用可能与OPTN功能障碍使得小胶质细胞内NF-κβ信号通路激活有关。本研究结果可为进一步探究ALS-12型的致病基因OPTN的发病机制提供新思路。