胶体金层析技术快速检测中药中赭曲霉毒素A研究

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胶体金标记技术是继荧光素标记、放射性同位素标记和酶标记三大重要标记技术后的又一重要标记技术,已在生物医学、药物残留、激素检测、危险品检测、毒品快速检测、临床诊断、离子检测、食品安全检测等领域得到了广泛应用。胶体金层析技术是胶体金标记技术与层析技术良好结合的新技术,按照与胶体金颗粒相结合物质类别的差异,可分为胶体金免疫层析法和胶体金适配子层析法。  赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由曲霉菌属和青霉菌属等产生的有毒代谢产物,对人和动物的生命健康危害极大,有很强的肾毒性及致癌、致畸和免疫抑制作用等,有研究指出,它主要通过促进膜的过氧化,抑制线粒体呼吸作用亦或是影响细胞信号传导过程中蛋白和其他关键因子的转录表达等过程从而产生致毒效应,已被国际癌症组织(IARC)定义为人类可能的致癌物(2B级)。中药材作为我国传统医学的精华,使用历史悠久。然而,中药同粮食、谷物等众多农作物一样,种植、生长、采收、加工、炮制以及储存等过程中,均可能受曲霉菌属和青霉菌属等真菌污染进而产生赭曲霉毒素A,很有必要建立灵敏准确的中药中OTA快速检测技术。基于此,本论文建立了中药中OTA的胶体金层析快速检测技术,并采用液质联用技术对新技术检测结果进行确证。主要研究内容和结论如下:  (1)建立了胶体金免疫层析方法快速检测赭曲霉毒素A(OTA)。  采用Frens法制备合适粒径的胶体金溶液,并用紫外分光光度计在400-800nm进行全波长扫描,计算胶体金颗粒粒径,透射电镜下观察颗粒表观,形状以及大小等。反复试验,最终确定及稳定所需粒径的胶体金溶液烧制方法。考察胶体金标记抗体最低稳定量以及胶体金标记抗体最适pH,同时筛选检测线、控制线溶液浓度以及耗材型号等,选择最佳条件制备试纸条。进行试纸条性能考察,结果发现,所制备试纸条稳定,可长期保存,对OTA的检测灵敏度为5 ng/mL,且特异性良好,不与其他真菌毒素发生交叉反应。  (2)建立了胶体金适配子层析方法快速检测赭曲霉毒素A(OTA)。  制备合适粒径的胶体金溶液,考察胶体金标记适配子最低稳定量,注意考察优化最佳偶联条件,同时筛选检测线、控制线溶液浓度以及耗材型号等,选择最佳条件制备试纸条。进行试纸条性能考察,其灵敏度为5 ng/mL,并且特异性良好,不与其他真菌毒素发生交叉反应。且相较胶体金免疫层析试纸条,成本明显降低。试纸条检测试验可重复,且长期保持稳定。  (3)建立了检测中药中OTA的UFLC-MS/MS方法,并对胶体金免疫层析试纸条和胶体金适配子层析试纸条的检测结果进行验证。  样品经80%的甲醇(水)溶液提取,以水(含0.1%甲酸)/乙腈(含0.1%甲酸)为流动相,采用梯度洗脱的方法进行液相色谱分离,在多反应监测模式(MRM)下,1.0-40.0 ng/mL范围内,OTA的线性相关系数分别为0.9993。 OTA高中低三个添加水平的回收率在78.83%~91.74%之间,相对标准偏差在1.39%~6.24%之间。该方法简单快速、灵敏度高和选择性好,适用于中药中真菌毒素OTA的检测。采用所建立的UFLC-MS/MS方法验证了所制备的胶体金层析试纸条检测样品的结果。
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