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一、研究背景与目的 人ANGPTL4基因是一种新近发现的血管生成相关基因。其蛋白质由406个氨基酸构成,分子量约为60000。最近研究显示人ANGPTL4在人组织中的表达为:正常肝组织≥癌旁肝组织>肝癌组织,并且人ANGPTL4基因在胎盘中高表达,在心、肝脏、肌肉、胰腺、肺中度表达,在脑、肾弱表达,人ANGPTL4具有抑制HCC生长的作用。先前的研究中,人ANGPTL4基因主要通过质粒在脂质体介导下导入靶细胞,人ANGPTL4基因在靶细胞中的表达是瞬间的,只能持续数日,并且脂质体介导人ANGPTL4基因的转染率较低。因此,本研究为进一步了解人ANGPTL4基因的抗肿瘤作用和探索一种有效的肝癌治疗模式,通过逆转录病毒载体介导人ANGPTL4基因的转移,获得稳定、高效表达该基因的人肝癌细胞系HepG2-ANGPTL4。 二、方法 以人肝细胞系HL-7702总RNA为模板,用RT-PCR法体外扩增出人肝癌相关基因ANGPTL4 cDNA,将其亚克隆至逆转录病毒载体质粒pMSCV,鉴定测序。脂质体法分别获得高滴度重组病毒pMSCV-ANGPTL4和空病毒pMSCV。用重组病毒pMSCV-ANGPTL4和空病毒pMSCV分别感染人肝癌细胞系HepG2。流式细胞术和荧光显微镜分别检测各组HepG2细胞GFP蛋白的表达。RT-PCR法分别检测各组HepG2细胞ANGPTL4 mRNA的表达。裸鼠成瘤实验和MTT实验分别检测各组HepG2细胞体内外生长情况。浙江大学博士学位论文1.细胞培养 293 EBNA细胞,NIH3T3细胞和HePG:细胞在含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中培养。用含10%胎牛血清的RPMI一1酬O细胞培养基培养人HL一7702细胞。以上细胞均培养于37℃,5%CO:中。2.基因扩增 从HL一7702细胞中提取总RNA,逆转录1雌总.RNA合成单链cDNA（si nglestrand cDNA,55一eDNA）。由于人ANGPTL4基因cl)NA较长,约1 .2kb,将其分成A、B两片段分别扩增。50林1 PCR反应体系包括2.sng 55一cDNA,,5林1 10/pCR缓冲液buffer,1 .5林1 10mM dNTp,3林1 10林M引物和0.5抖l承DNA聚合酶。94oC预变性1 omin,然后94oC,变性305;6扭;oC,复性、延伸905;循环扩增30次。最后1个循环68℃延伸5 min。凝胶回收上述PCR扩增的A、B基因片,EcoRI分别酶切,酶切产物用T4 DNA连接酶体外连接后得到完整人ANoPTL4 eDNA,通过人工引物接头,其5’和3’末端分别含有Bgl 11 and Hapl酶切位点。引物序列如下: A片段:FSGGAAGATCTATGAGCGGTGCTCCGACGGC3 434bP Bgl 11 R SCTTTGCAGATGCTGAATTCGCAGGTGCTG3 EeoRI B片段:FSACCTGCGAATTCAGCATCTGCAAAGCCAG3 830bP EeoRI R SGGGGTTAACCTAGGAGGCTGCCTCTGCTG3 HPal3.重组逆转录载体质粒的构建 逆转录病毒载体质粒pMscv含有编码绿色荧光蛋白的基因GFP。GFP基因为一报告基因,具有提示外源基因成功转导和表达的作用。限制性内切酶BglH和Hapl分别酶切载体质粒pMSCV和人ANGPT14 cDNA,酶切产物凝胶回收,T4 DNA连接酶体外连接,构建重组逆转录病毒载体质粒。含有人ANGPTL4cDNA重组逆转录病毒载体质粒被命名为pMSCV-ANGPTL4。此重组质粒通过PCR,限制性内切酶和DNA测序鉴定。浙江大学博士学位论文4.重组逆转录病毒的包装 脂质体法将逆转录病毒载体质粒pMSCVANGf,TL4/pMSCV、pVSV（plasmidof vesieular stomatitis virusG）、pGAG一pOL共转染293 EBNA包装细胞,转染24h后,用含有10%胎牛血清的DMEM培养液换液终止转染,293 EBNA包装细胞继续培养。之后每24h收集含有重组逆转录病毒的细胞培养上清,收集三次,即获得重组逆转录病毒pMscv-ANGPTL4和逆转录空病毒pMScv。稀释病毒上清后感染NIH3T3细胞,通过流式细胞仪检测NIH3T3细胞的GFP表达和被感染阳性细胞率,从而计算出病毒滴度。病毒滴度计算公式如下:病毒滴度（感染性病毒颗粒/ml）=MH3T3细胞总数又阳性细胞率/病毒上清量（ml）。病毒收集一70℃保存。5.逆转录病毒感染 接种HepG:细胞于96孔平板（1 x 1 04/孔）,培养24h一 4sh。待细胞融合至60%时,无血清DMEM培养液漂洗细胞两次,每孔加入含有25川病毒上清和8川聚凝胶（100mg/L）的无血清DMEM培养液100协l。乡浮育sh后,用含100,0胎牛血清的DMEM培养液换液,终止感染。继续培养2d后,荧光显微镜观察感染后的HepG:细胞GFP表达,挑选高表达的HePG:细胞继续培养。lw后,流式细胞仪测定被感染阳性细胞率和平均荧光强度。6.基因的表达 感染两周后,分别提取感染重组病毒的HePGZ一厂州GPTL4细胞、感染空病毒的HepGZ一pMSCV细胞、未感染病毒的HepG:细胞总RNA,以p一aetin为内参照,RT一PCR法检测ANGPTL4 mRNA表达。PCR参数:94℃预变性,Zmin,94℃变性,30 5; 61.5℃复性,305;72℃延伸,605循环扩增34次。最后1个循环72’C延伸5 min。扩增产物电泳,拍照。CMIAS一8图像分析系统分析电泳结果,检测各组ANGPTL4和p一actin积分光密度值,ANGPTL4与内参照p一actin积分光密度值相除,所得数值即为各组ANGPTL4m租叮A表达,两者成正比。引物序歹,1如下:ANGPTL4:F SGGCGAGTTCTGGCT‘3GGTCT3 329bP R STGGCCGTTGAGGTT〔奋GAATG3 乃一aetin:F SAGCGGGAAATCGTG(:GTGAC3 5 1 lbP R SAAGCATTTGCGGTG(资ACGAT3