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前言前列腺癌为全世界特别是欧美国家男性常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。我国随着人口老龄化、生活习惯的改变及医疗检测水平的提高,发病率逐年上升。美国NCBI收录了大量来自不同的正常及肿瘤组织的基因表达系列分析(SAGE)数据库,通过CGAP提供的免费在线分析软件筛选并研究前列腺癌与正常组织的差异表达基因,可以发现新的前列腺癌相关基因,然后用生物医学方法证实,为分析前列腺癌新的诊断方法和治疗途径奠定重要的理论及实验基础。我们在前期实验中利用NCBI提供SAGE数据库及分析软件获得了前列腺癌与正常组织的差异表达基因,确定功能完全未知的BRP44基因为进一步研究的兴趣基因。通过Northern Blot实验证实:BRP44在前列腺癌组织的表达丰度高于良性前列腺瘤组织,BRP44在LNCaP细胞中高表达而在PC-3细胞中不表达。生物信息学方法初步推断BRP44可能是一个在转录或者翻译水平控制肿瘤细胞线粒体某些基因表达的调节因子。BRP44蛋白在LNCaP细胞的细胞核及细胞浆均有表达,在胞浆的表达相比胞核更强。RNA干扰实验证实BRP44对LNCaP细胞的生长增殖起着负向调节作用,在LNCaP细胞合成PSA的通路中不起关键作用。而BRP44对PC-3细胞的影响是本课题研究的任务。实验方法培养LNCaP细胞及PC-3细胞,提取LNCaP细胞总RNA,通过RT-PCR合成BRP44基因片段,与质粒真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A构建成质粒真核表达重组体pcDNA3.1/myc-His A- BRP4,通过脂质体转染法转染PC-3细胞,经过一段时间培养、筛选、挑取细胞亚克隆,最终获得稳定高效表达BRP44的PC-3细胞系。实验结果本实验对BRP44基因目的片段的PCR扩增产生的特异性条带约500 bp,与预计片段大小相同。对pcDNA3.1/myc-His A- BRP44真核表达载体的双酶切,结果显示重组体产生一个约500 bp的特异性条带,与PCR扩增片段结果一致。重组体送上海Sangon公司进行测序,序列分析序列与已经公布的BRP44基因的核苷酸序列完全一致,插入片段位置及方向性正确,表明pcDNA3.1/myc-His A- BRP44真核表达载体构建成功。转染pcDNA3.1/myc-His A-BRP44的PC-3细胞经过G418的反复筛选,最后获得表达G418抗性的细胞亚克隆15个。RT-PCR检测基因BRP44在PC-3细胞亚克隆的表达,目的片断大小约为500 bp,与预计片段大小相同。通过Northern检测证实,G418筛选出的5个细胞亚克隆有不同程度的目的基因表达,把表达BRP44最强一个细胞亚克隆进一步培养并大量冻存以备后用。结论本研究构建的pcDNA3.1- BRP44真核表达载体,转染PC–3细胞后获得了高效稳定表达BRP44的细胞亚克隆,可用于进一步观察获得BRP44基因高表达后的PC–3细胞亚克隆相应生物学行为的改变,为初步得到BRP44的功能提示及与前列腺癌发生发展的关系打下基础。