三种致病菌的微流控芯片阻抗检测研究

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面对国内出现的多起严重威胁社会公共安全的食品和水源中致病菌中毒事件,以及现有致病菌检测技术存在的检测时间长、检测设备庞大、操作繁杂、方法不成熟等等不足,本研究利用具有梯度阵列金电极的微流控芯片,搭建了用于细菌快速准确检测的微流控芯片阻抗分析系统,采用微流控芯片上细菌阻抗定量检测法及细菌免疫磁珠分选-DEP富集和微流控芯片阻抗检测法用于细菌快速、灵敏、准确的检测,为食品和水源中背景复杂、低含量的细菌(致病菌)的快速准确检测提供了新方法,对食品安全和环境卫生的评价具有重要研究价值和应用前景。基于阻抗检测原理,以微米级尺寸的梯度阵列金电极和微通道的微流控芯片为检测平台,搭建了微流控芯片阻抗检测分析系统。基于该系统,结合细菌悬浮液阻抗特性,建立了微流控芯片上细菌阻抗定量检测模式;同时结合免疫磁珠分选技术和介电电泳富集技术建立了细菌免疫磁珠分选-DEP富集和微流控芯片阻抗检测模式,通过实验显示两种阻抗检测模式有效可行,可以减少样品用量、缩短检测时间、提高信噪比。利用微流控芯片阻抗分析系统,在微流控芯片上细菌阻抗定量检测模式下,在500mV,100Hz~1MHz下对悬浮于5.0μS/cm0.1M甘露醇缓冲液中的金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌进行阻抗谱测定,以1KHz下的阻抗值(|Z|)与细菌的浓度(C)建立定量关系曲线,发现|Z|-logC呈线性关系,相关系数都大于0.98,检测限分别为2.12×105CFU/mL、8.80×105CFU/mL、2.32×104CFU/mL,检测时间在10min内。该方法与传统的平板计数法相比,相对误差和相对标准偏差在允许范围内,说明该系统和方法具有良好的准确性和稳定性。考察两种致病菌和三种致病菌的混合物的阻抗谱响应,发现细菌的阻抗是缓冲液中致病菌的共同作用结果,无法实现对混合细菌的总菌和某种特定细菌的定量测定。因此,提出了细菌免疫磁珠分选-DEP富集和微流控芯片阻抗检测方法。采用原位合成法制备了具有大的比表面积的复合纳米磁珠Fe3O4@SiO2,并对其表面进行氨基化改性得到Fe3O4@SiO2-NH2。然后利用Fe3O4@SiO2-NH2和EDC/NHS的交联作用,Fe3O4@SiO2-NH2与鼠伤寒沙门氏菌抗体共价结合制备得到免疫磁珠IMNPs。0.2mg/mL IMNPs与混合细菌中的鼠伤寒沙门氏菌孵育2h,分选得到IMNPs-鼠伤寒沙门氏菌复合物。利用微流控芯片阻抗分析系统,在细菌免疫磁珠分选-DEP富集和微流控芯片阻抗检测模式下,施加6Vp-p/500KH的交流信号对IMNPs-鼠伤寒沙门氏菌复合物进行富集并在500mV的扰动下进行阻抗测定,建立了IMNPs-鼠伤寒沙门氏菌复合物中鼠伤寒沙门氏菌浓度(C)与10KHz下阻抗值(|Z|)间的定量关系|Z|=-29131logC+225893(R2=0.9404),检测限为1.81×102CFU/mL,检测时间为2.5h。与传统的平板计数法相比,具有良好的准确性和稳定性,同时具有较好的选择性。综上所述,利用微流控芯片阻抗分析系统,在微流控芯片上细菌阻抗定量检测模式下对单种细菌的定量检测具有快速、准确的优点;在细菌免疫磁珠分选-DEP富集和微流控芯片阻抗检测模式下,可对混合细菌中目标菌进行特异性定量测定,检测限较微流控芯片上细菌的阻抗定量检测法降低了3个数量级,有高选择性、高灵敏度、准确快速的优点。两种方法为食品和水源中致病菌的快速准确检测奠定了方法基础,同时为相应系统的集成化和微型化也为致病菌的现场快速准确检测指明了方法。
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