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灵芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide, GLP)是从中草药灵芝中提取的一种生物活性多糖。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一,已受到国内外生物医药领域的高度关注,历来在人体保健上发挥着良好的作用。国内外已有大量文献报道,灵芝多糖对人和小鼠的免疫功能具有显著的促进作用,具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖等广泛的药理作用,并且无毒副作用,无残留。这提示我们灵芝多糖具有作为畜禽免疫增强剂研究开发应用的价值。本文研究了灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响、对鸡外周血淋巴细胞细胞因子表达的影响以及对新城疫免疫雏鸡免疫功能的影响,旨在为灵芝多糖作为鸡免疫增强剂的临床推广应用提供理论依据。1.灵芝多糖的急性毒性试验目的：测定灵芝多糖对大鼠的口服LD50,从而确认灵芝多糖的口服急性毒性作用。方法：预实验,健康SD大鼠12只,体重为180～220 g,随机分为3组,每组4只(雌雄各半),分开饲养。分别按1 ml/100 g的剂量灌服500 mg·ml-1、100 mg·ml-1、0 mg·ml-1的灵芝多糖溶液,24小时灌胃1次,观察大鼠的精神状态、饮食和死亡情况。正式实验：根据预实验结果,取健康SD大鼠10只,体重为180～220 g,雌雄各半,分开饲养,分别按1 m1/100 g的剂量灌服500 mg·ml-1的灵芝多糖溶液,24小时灌胃1次。观察记录给药后大鼠的反应及死亡情况,重复2次。结果：在整个急性毒性试验过程中大鼠无一死亡,500mg·ml-1灵芝多糖组共出现1只雌鼠短时间拉稀,后转好,解剖对肉眼可见脏器如心、肝、脾、肺、肾等亦未见到有毒性损害,灵芝多糖给药量已达到5000mg·ml-1。结论：根据《兽药注册资料汇编》中兽药急性毒性试验指导原则的要求中的大鼠外源化学物相对毒性分级标准,灵芝多糖为实际无毒,应用安全。2.灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响目的：探明灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖的作用,体外筛选效果较佳的药物浓度。方法：安全浓度测定,无菌分离鸡外周血淋巴细胞,用细胞培养液调整密度为5×106/mL,加入到96孔板,100 μL/孔,重复4孔。将自45 mg·ml-1开始稀释至1.125mg·mL-1的7种浓度的灵芝多糖分别加入到淋巴细胞液上,同时设置不加药物的细胞对照组,MTT法测定,以A490值不显著低于细胞对照组的灵芝多糖最大浓度作为安全浓度。取安全浓度范围内2250μg·mL-1倍比稀释至17.578μg·mL-1 7种浓度的GLP单独或与伴刀豆素球蛋白(ConA,终浓度为10μg·mL-1)共同刺激鸡外周血淋巴细胞,同时分别设置细胞对照组和ConA对照组,培养48 h,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果：灵芝多糖安全浓度达到9 mg·mL-1以上,单独刺激试验显示,当GLP浓度大于70.3125μg·mL-1, A490值显著大于空白对照组(P<0.05),与ConA共同刺激试验显示,当GLP浓度大于140.625 μg·mL-1, A490值显著大于ConA对照组(P<0.05),并且都呈现出明显的量效关系。结论：灵芝多糖能够单独促进外周血淋巴细胞增殖,也能与有丝分裂原ConA共同显著促进鸡外周血淋巴细胞的增殖。3.灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞IFN-γ, IL-6的mRNA表达的影响目的：研究灵芝多糖对鸡外周血IL-6mRNA和IFN-y mRNA表达水平的影响。方法：首先用Oligo7软件设计了一对干扰素-γ (Interferon γ, IFN-γ)引物和白介素-6(Interleukin 6, IL-6)引物,再无菌分离鸡外周血淋巴细胞,使密度为1×107/mL,设置450、225、112.5μg·mL-1以及450、112.5、28.125μg·mL-1的灵芝多糖浓度,并与ConA(终浓度为10μg·mL-1)共同孵育淋巴细胞12小时,同时设置ConA对照组和细胞对照组,常规提取RNA,反转录,用荧光定量PCR相对定量法测定GLP对鸡外周血淋巴细胞IFN-γ, IL-6的]mRNA表达水平。结果：与ConA对照组相比,灵芝多糖在112.5μg·mL-1能够显著促进IFN-y mRNA的表达(P<0.05),在450、225μg·mL-1能显著促进IL-6 mRNA的表达(p<0.05)。结论：GLP可以促进鸡外周血淋巴细胞IFN-y, IL-6的1nRNA表达。4.灵芝多糖对新城疫免疫雏鸡免疫功能的影响目的：探究灵芝多糖对新城疫免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖、抗体效价以及免疫器官指数的影响。方法：1日龄非免疫罗曼蛋公鸡饲养至14日龄,随机选取175只,分为7组,每组25只,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ苗滴鼻、点眼免疫,1羽份/羽,28日龄二免。在每次免疫的同时,5个多糖试验组分别按100 mg·kg-1,50 mg·kg-1、 25mg·kg-1、12.5mg·kg-1、6.125 mg·kg-1灌服灵芝多糖溶液,连续3天,免疫对照组和空白对照组不给药。在首免后第7天、14天、第21天、第28天分别测定新城疫抗体效价和外周血淋巴细胞增殖活性。在首免后第7天、二免后第7天分别测定脾脏、法氏囊的器官指数。结果：在整个试验期间,各组鸡在给药后均精神活泼,采食、饮水、粪便正常,未出现任何不良反应,无发病和死亡现象。25 mg·kg-1·bwg剂量组灵芝多糖溶液在多个时间点对鸡外周血淋巴细胞增殖、抗体生成均显著高于免疫对照组和空白对照组(p<0.05)。另外,灵芝多糖还能提高脾脏和法氏囊的免疫器官指数。结论：灵芝多糖对雏鸡安全,能增强鸡新城疫苗的免疫效果。