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研究背景神经病理性疼痛由神经系统的损害或炎症引起,是一种常见而特殊的慢性疼痛,以痛觉过敏、异常痛敏和自发痛为特征。目前发病机制不清,发病率逐年上升,处理非常棘手而且目前的治疗方法疗效不佳,是医学领域的挑战性研究课题。众多研究表明外周和中枢敏化在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥重要作用。外周和中枢敏化均与初级感觉神经元、次级感觉神经元以及胶质细胞上疼痛相关分子和受体基因的转录和表达水平的改变密切相关。表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,主要体现在DNA碱基上发生的甲基化修饰、染色质重塑、基因印记、X-染色体失活以及非编码RNA调控等方面。其中DNA甲基化是最早发现又普遍存在的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA高甲基化能关闭相关基因的活性,去甲基化则可以诱导基因的重新活化和表达。于是推测,表观遗传学机制尤其是DNA甲基化机制很可能参与神经病理性疼痛的发生发展。相关研究较少,本课题的开展和顺利完成可为神经病理性疼痛的机制和治疗研究提供新的思路和方向。研究目的观察总体DNA甲基化水平在坐骨神经慢性压迫性损伤(chronicconstriction injury, CCI)大鼠脊髓腰膨大中的变化；观察DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs) DNMT1、DNMT3a和DNMT3b及甲基化CpG连接蛋白2(methyl-CpG-binding protein2, MeCP2)在CCI大鼠脊髓腰膨大中表达的变化；观察神经病理性疼痛重要相关因子谷氨酸脱羧酶67(glutamate decarboxylase67, GAD67)在CCI大鼠脊髓腰膨大中表达的变化及其编码基因GAD1启动子甲基化水平在CCI大鼠脊髓腰膨大中的变化；采用DNMT特异性抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AZA)鞘内注射,观察其对CCI大鼠神经病理性疼痛的调节作用,探索神经病理性疼痛的DNA甲基化调控机制。研究方法1.雄性Sprague-Dawley (SD)成年大鼠随机分为假手术组(sham组)和CCI组,测量各组大鼠机械痛阈和热痛阈基础值后,参考Bennett和Xie等的方法构建大鼠左侧CCI模型；sham组进行同样的手术,暴露坐骨神经但不结扎。分别于术后第3、5、7、10、14天再次测定各组大鼠的机械痛阈和热痛阈。各组大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死,取脊髓腰膨大段测定其总体DNA甲基化水平。2. Sham组和CCI组大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死,取脊髓腰膨大段采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)方法检测其DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及MeCP2的表达。3. Sham组和CCI组大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死,取脊髓腰膨大段采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative RT-PCR, qRT-PCR)方法检测其GAD67mRNA的表达,采用焦磷酸测序方法检测其编码基因GAD1启动子区域的甲基化水平。4.腰段鞘内置管成功的雄性SD成年大鼠随机分为3组：假手术±生理盐水组(sham+NS组)、CCI+生理盐水组(CCI+NS组)、CCI+5-AZA10μM组(CCI+5-AZA组)。术后第3天开始鞘内注射NS或5-AZA10μM(溶于NS),每天一次,每次10μl,持续至第14天。分别于术前及术后第3、5、7、10、14天测定大鼠的机械痛阈和热痛阈,术后14天测试后于深麻醉下处死取脊髓腰膨大段行总体DNA甲基化水平,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的表达,GAD67的表达及GAD1基因启动子区域的甲基化水平等相关检测。研究结果1.术前两组大鼠机械痛阈和热痛阈无明显差别(P>0.05),术后第3天,CCI组机械痛阈和热痛阈较sham组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),于术后第7天降至最低点(P<0.05),并持续至第14天(P<0.05)。脊髓腰膨大处总体DNA甲基化水平测定,显示术后14天CCI组较sham组总体DNA甲基化水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。2.术后14天,RT-PCR的结果显示,较sham组比较,CCI组大鼠脊髓腰膨大处DNMT1mRNA表达无明显改变(P>0.05),DNMT3a、 DNMT3b和MeCP2的mRNA表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,CCI大鼠的脊髓腰膨大处细胞核内的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2蛋白表达较sham组均明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。脊髓腰膨大处免疫组化显不DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2阳性细胞均以灰质表达为主,于灰质全层均有较多表达,在脊髓背角致密表达。阳性颗粒主要位于胞核,胞浆可见少量表达。CCI组脊髓背角处DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的阳性表达较sham组明显增多。3.术后14天,脊髓腰膨大处,qRT-PCR方法显示CCI组大鼠GAD67mRNA的表达明显低于sham组,差异有统计学意义(P<0.05),焦磷酸测序方法显示GAD1基因启动子区域的甲基化水平明显高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)4. CCI+5-AZA组较CCI+NS组从术后5天(鞘内给药2天后)起机械痛阈和热痛阈明显上升,差异有统计学意义(P<0.05),并持续至术后14天(P<0.05)。术后14天,脊髓腰膨大处,CCI+5-AZA组较CCI+NS组比较,总体DNA甲基化水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05); DNMT1mRNA表达无明显改变(P>0.05),DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的mRNA表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),细胞核内的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05); GAD67的mRNA表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05), GAD1基因启动子区域的甲基化水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示鞘注5-AZA10μM未对大鼠脊髓组织产生明显的损害。研究结论1.CCI大鼠脊髓腰膨大处总体DNA甲基化水平明显上升,并与CCI大鼠神经病理性疼痛行为学变化相平行,提示脊髓腰膨大处总体DNA甲基化水平的异常增加很可能在CCI大鼠神经病理性疼痛发病机制中起重要作用。2. DNMT1、DNMT3a、 DNMT3b和MeCP2在CCI大鼠脊髓腰膨大处表达均明显上调,并与CCI大鼠神经病理性疼痛行为学变化相平行,提示脊髓腰膨大处DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2表达上调很可能协同参与了CCI大鼠神经病理性疼痛的发生发展。3. GAD67mRNA在CCI大鼠脊髓腰膨大表达明显下降,其编码基因GAD1启动子区域甲基化水平明显增加,并与CCI大鼠神经病理性疼痛行为学变化相平行,提示GAD67表达下调及GAD1启动子甲基化水平增加很可能在CCI大鼠神经病理性疼痛的发生发展中起重要作用。4.鞘内注射5-AZA10μM可以明显缓解CCI大鼠的神经病理性疼痛,并能在脊髓腰膨大处降低总体DNA甲基化水平,抑制DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的表达,上调GAD67的表达,降低GAD1启动子甲基化水平,进一步提示DNA甲基化很可能在CCI大鼠神经病理性疼痛发病机制中起重要作用；5-AZA可考虑成为神经病理性疼痛治疗的潜在药物。