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油菜是世界范围内广泛种植的油料作物，是世界食用植物油和植物蛋白的重要来源，近十年来其种植面积不断扩大，目前已成为世界第二大植物油来源，在国际农产品贸易中占有重要的地位。植物油是栽培油菜的主要农产品，它不仅是人和动物必须脂肪酸的主要来源，也是生产油漆、润滑剂、化装品、尼龙等化工产品的重要原料。与加拿大等国家相比，我国多数油菜品种的含油量偏低，尤其是长江流域冬油菜主产区的菜籽含油量比加拿大的低2～3个百分点，因此，高含油量油菜育种品质育种具有十分重要的现实意义。。植物油的含量与丙酮酸羧化酶（PEPC）和二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT；EC2．3．1．20）密切相关。丙酮酸羧化酶（PEPC）控制油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮的流向，从而决定植物种子蛋白质／油脂含量比例：二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT；EC 2．3．1．20）是催化三脂酰甘油（TAG）合成的最后也是最关键的限速酶，对植物种子中的油脂含量具有十分重要的调控作用。为了提高油菜种子中的含油量，本研究从拟南芥及油菜中分别克隆DGAT基因及PEPC基因片断，构建DGAT及反义PEPC种子特异性表达载体，通过农杆菌共转化的方式将DGAT及反义PEPC基因导入油菜，使其在同一株植物中表达。一方面抑制种子中PEPC基因的表达，使其底物（丙酮酸）更多地朝生成油脂的方向流动，另一方面加快油脂合成速度，减少反馈抑制，以望获得高含油量的转基因油菜。主要结果如下：1 DGAT基因的克隆及其种子特异性植物表达载体的构建用同一对引物从拟南芥花柱基因组和总RNA中扩增了DGAT全长编码基因，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明：拟南芥DGAT基因的DNA长3020 bp，cDNA长1563bp。对测序结果进行比较发现，该基因由16个外显子和15个内含子组成，编码520个氨基酸蛋白，推测其分子量为59.0kDa，等电点pI=8.53。将拟南芥DGAT酶蛋白序列与油菜、大豆、烟草、水稻的DGAT酶蛋白序列比较，发现它们同源性较高，分别为89％、73％、69％、66％，而与动物（鼠）的同源性较低，只有38％的同源性。同Kenndy途径中的3-磷酸甘油酰基转移酶（G3PAT）、溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）比较，发现没有很大的相似性，表明它们并不相关。用扩增引物上设计的BamHI酶切位点将DGAT基因切下，插入到pBI121.N质粒的Napin启动子BamHI酶之后，构建种子特异性表达载体，经过平PCR和限制酶切的方法筛选到DGAT正义表达载体，将DGAT cDNA重组正义表达载体命名为pBI121．ND1，DGAT DNA重组正义表达载体命名为pBI121．ND2，通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404，并经菌落PCR验证。2．PEPC基因片段的克隆和种子特异性反义PEPC基因植物表达载体的构建利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEPC基因片段，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明：扩增片段长576bp，与Yanai报道的PEPC基因相应区域的同源性为95％。用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下，反向插入到pBI121．N质粒的Napin启动子之后，构建了种子特异性反义PEPC表达载体pBI121．NP。通过冻融法将pBI121．NP转化农杆菌LBA4404，并经菌落PCR验证。3．甘蓝型油菜的遗传转化和转基因植株的获得对甘蓝型油菜子叶节再生体系和遗传转化体系进行了优化，通过农杆菌共转化的方式，将DGAT cDNA种子特异性正义表达载体及PEPC反义表达载体基因转化到湘油15号，获得了抗卡那霉素油菜转基因苗，经PCR检测和Southern杂交分析，DGAT或反义PEPC基因整合到湘油15基因组中植株共11株，其中2株同时转入PEP和DGAT基因，5株只转入PEPC单基因的，4株只转入DGAT单基因。4．转PEPC及DGAT基因在油菜中的表达及对种子内油脂和蛋白质代谢的影响研究发现DGAT在转基因植株中均能表达，在油菜种子中表达水平高，在叶中以低水平表达。转反义PEPC基因的植株种子中的PEPC活性下降，最多的可下降21.5％。11株转基因油菜种子中的油脂含量及种子重量普遍增加，其中油脂含量增加0.7～6.9个百分点，代表总净量增加1.7～17.4％，以同时转入PEPC和DGAT两个基因植株油脂含量增幅效果好；而蛋白质的含量则有不同程度的降低，下降幅度为5～11％左右，相关分析表明：种子中的蛋白质含量与油脂含量呈显著的负相关，相关系数为—0.8801。