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研究目的:建立一种具有高灵敏性与特异性并且性能稳定的多重实时荧光定量PCR方法,可直接检测粪便样本中的产毒艰难梭菌并准确判断其产毒类型;另外,建立一种检测艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变的双重荧光定量PCR方法,来判断该基因是否发生点突变,进而预测被检菌株是否对莫西沙星耐药。研究方法:多重实时荧光定量PCR方法以艰难梭菌三个毒素基因tcdA、tcdB和cdtB作为靶基因,通过其保守序列设计引物和Taq-Man探针,纯化普通PCR产物,构建质粒标准品,梯度稀释后制作标准曲线,确定该方法对纯菌DNA的检测下限并与普通PCR的检测下限作比较;使用常见6种肠道致病菌（大肠埃希菌、屎肠球菌、粪肠球菌、肉毒杆菌、产气荚膜杆菌、脆弱类杆菌）以及产毒艰难梭菌标准株验证该方法的特异性;不同批次多次重复检测以验证该方法的重复性;将倍比稀释的菌液加入健康人粪便样本中,构建模拟粪便标本,确定该方法对粪便样本DNA的检测下限;使用该方法对69株艰难梭菌分离株的纯菌DNA以及74份粪便DNA进行检测,用金标准（产毒培养）来评价该方法的性能。双重实时荧光定量PCR方法针对gyrA基因设计引物,针对耐药株和敏感株突变位点设计不同的TaqMan-MGB探针,优化同时检测ATT、ACT突变点的双重荧光定量PCR体系,验证该方法的灵敏性、特异性和重复性,使用普通PCR对73株艰难梭菌临床分离株的gyrA基因进行扩增、测序和比对,同时用建立的双重荧光PCR方法对这73株临床分离株进行检测,评价两种方法的一致性。研究结果:针对产毒艰难梭菌建立的多重荧光定量PCR设计的3对引物退火温度和GC含量均符合要求,优化体系和参数后三个目的基因的扩增效率分别为102%、103%、102%。tcdA基因普通PCR的检测下限为102copies/μL,优化的荧光PCR（101 copies/μL）灵敏性是普通PCR的10倍。tcdB基因普通PCR的检测下限为103 copies/μL,tcdB优化的荧光 PCR（100 copies/μL）灵敏性是普通 PCR 的 1000倍。cdtB基因普通PCR的检测下限为102 copies/μL,优化的荧光PCR（100 copies/μL）灵敏性是普通PCR的100倍。特异性评价除产毒艰难梭菌外其他6种肠道致病菌均未出现扩增曲线;重复性评价组内变异系数及组间变异系数均小于3%;针对粪便样本DNA的检测下限分别为:100、103、102CFU/g;与金标准产毒培养结果比较,69个纯菌DNA的灵敏度和特异度均达到100%,74个粪便样本DNA的敏感度和特异度分别为 96.49%（55/57）和 94.12%（16/17）。针对耐莫西沙星gyrA基因点突变的双重荧光定量PCR方法其耐药株和敏感株的检测下限分别为4.11 copies/μL、5.14 copies/μL,6种常见肠道细菌模板均扩增阴性,体系的检测特异度为100%。重复性检测三个梯度的组内变异系数和组间变异系数均小于5%。测序结果与荧光定量PCR结果的一致性检验得k=0.97（p<0.05）。研究结论:本研究建立的直接从粪便样本中检测产毒艰难梭菌的Taq-Man多重实时荧光定量PCR方法可对产毒艰难梭菌做出准确识别,针对纯菌DNA和粪便样本DNA均具有很高的敏感度和特异度,且检出结果稳定;该方法可配备POCT（point-of-care testing）用于快速检测和识别临床艰难梭菌感染病例,因客观原因样本量较少,后续还需更多的临床标本来大规模验证该方法性能。另外,针对艰难梭菌耐莫西沙星gyrA基因点突变建立的双重荧光PCR方法灵敏且具有很高的特异性和重复性,对于该耐药基因点突变的鉴别高效且准确。