背景由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的、主要经呼吸道传播的结核病（tuberculosis，TB）是目前世界范围内造成死亡人数最多的传染病。卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）的接种虽然能够有效预防儿童TB的发生，但是无法防止成人的TB感染和潜伏感染的复发。由于对疫苗作用机制和MTB致病机制研究缓慢，使得研发比BCG更为安全有效的预防疫苗极其困难。TB化疗中使用的异烟肼（Isoniazid acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）等药物主要针对生长活跃的MTB，对生长缓慢、代谢迟缓的MTB休眠菌的杀伤效果不明显，而且化疗存在治疗周期长、毒副作用大、患者依从性较差等问题，加之TB耐药形式的日益严峻，因此迫切需要研发新型的抗TB药物和疗法。治疗性疫苗的接种可刺激机体产生特异性的抗MTB免疫应答，有助于提高免疫系统对持留菌的识别和清除，从而缩短疗程，是目前TB研究的重要方向之一。目的建立MTB感染豚鼠模型，在此模型中评价融合蛋白Ag85B-ESAT-6＋Hsp65-hIL-2组合MPLA佐剂的亚单位疫苗单独和联合化疗药物的治疗效果及抑制MTB感染复发的能力；建立MTB感染小鼠模型，在此模型中评价上述亚单位疫苗的单独治疗和联合化疗药物治疗的效果。实验方法和结果一、融合蛋白Ag85B-ESAT-6的免疫学特性研究方法：使用原核表达系统分别表达Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2，Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白。以不同剂量（20μg、50μg、100μg、200μg、600μg）Ag85B-ESAT-6重组蛋白分别与50μg单磷酰脂质A（MPLA）佐剂混合后皮下多点注射方式免疫豚鼠，共免疫3次，每次间隔3周。每次免疫后2周取血分离血清，ELISA法检测免疫豚鼠血清特异性IgG抗体及IgG1和IgG2亚类滴度；末次免疫后2周处死豚鼠，分离外周血白细胞，流式细胞术检测外周血CD4+和CD8+T细胞比例。结果：纯化获得了纯化的重组融合蛋白Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2；以20μgAg85B-ESAT-6免疫2次即可诱导豚鼠产生较高水平的IgG抗体；3次免疫后，豚鼠外周血CD4+和CD8+T细胞比例均有所下降。二、融合蛋白亚单位疫苗对MTB感染豚鼠免疫治疗效果的评价方法：以105CFU MTB H37Rv经腹股沟皮下注射感染豚鼠，6周后平板计数法检测感染豚鼠肺脏和脾脏荷菌量，确立模型建立。之后将感染豚鼠分为感染未治疗组、免疫治疗组、化疗组、化疗联合免疫治疗组；另设未感染豚鼠正常对照组。化疗自感染后第6周开始，采用INH和RFP联用饮水治疗，饮水中药物浓度为108.5mg/LINH、105mg/L RFP，每周饮用5天，连续治疗11周；免疫治疗采用背部皮下接种，间隔一天给予10μgAg85B-ESAT-6＋10μg Hsp65-hIL-2＋5μg MPLA免疫两次，3周后以同样方法和剂量给予第二次免疫；全部治疗结束后（即感染第17周）给予各组豚鼠腹腔注射地塞米松1mg/只，每周3次，持续4周，以此进行免疫抑制诱导感染复发。实验过程中每周记录豚鼠体重；分次采血并检测血清特异性IgG抗体及IgG1和IgG2亚类水平；HE染色观察肺组织病理变化；流式细胞术检测外周血和脾脏CD4+和CD8+T细胞比例，总T和B细胞亚群比例；免疫治疗完成后4周（感染后17周）和免疫抑制完成后4周（感染后25周）处死豚鼠，平板计数法检测肺脏和脾脏荷菌量。结果：感染6周时豚鼠肺脏和脾脏出现肉眼可见的结核结节，荷菌量分别为5.82±0.29lgCFU和6.53±0.33lgCFU，表明豚鼠感染模型建立成功。感染10周后，未治疗组豚鼠体重停止增长，免疫治疗组豚鼠在免疫抑制后体重下降明显，至感染20周全部死亡；免疫治疗组和化疗联合免疫治疗组豚鼠血清中抗MTB特异性IgG水平显著高于感染未治疗组（P<0.001，P<0.001），且MTB特异性抗体的升高是以IgG2亚类为主；感染未治疗组豚鼠肺组织呈现严重炎症病变，而药物治疗组和化疗联合免疫治疗组的豚鼠病理改变较轻；与感染未治疗组相比，免疫治疗和化疗联合免疫治疗组豚鼠外周血和脾脏T细胞水平呈上升趋势，其中CD8+T细胞比例上升较明显；治疗结束后，免疫治疗组、化疗组和化疗联合免疫治疗组肺脏荷菌量均显著低于感染未治疗组（P<0.05，P<0.05，P<0.01），化疗组和化疗联合免疫治疗组豚鼠脾脏荷菌量显著低于感染未治疗组（P<0.01，P<0.01），免疫抑制后，化疗联合免疫治疗组豚鼠肺脏荷菌量显著低于化疗组（P<0.05）。三、融合蛋白亚单位疫苗对MTB感染小鼠免疫治疗效果的评价方法：以105CFU MTB H37Rv尾静脉注射感染C57BL/6J小鼠，4周后平板计数法检测感染小鼠肺脏和脾脏荷菌量，确立模型建立。之后将小鼠分为感染未治疗组、免疫治疗组、半程化疗组、半程化疗联合免疫治疗组、全程化疗组、全程化疗联合免疫治疗组；另设未感染小鼠正常对照组。化疗自感染后4周开始，采用INH和RFP联用饮水治疗（方法和剂量同上述豚鼠治疗实验），其中半程药物治疗时间持续4周，全程药物治疗持续11周；免疫治疗采用背部皮下接种5μg Ag85B-ESAT-6＋5μgHsp65-hIL-2＋5μg MPLA，在感染后第8周进行第一次免疫，3周后（感染后第11周）给予第二次免疫。治疗结束后处死豚鼠分离脾淋巴细胞，流式细胞术检测MTB抗原刺激后表达IFN-γ、IL-2、IL-4和TNF-α四种细胞因子的CD4+和CD8+T脾淋巴细胞的比例；平板计数法检测小鼠肺脏和脾脏荷菌量。结果：感染4周时小鼠肺脏和脾脏荷菌量分别为3.67±0.10lgCFU和3.54±0.14lgCFU，表明小鼠感染模型建立成功。与正常对照组小鼠相比，感染未治疗组和免疫治疗组小鼠脾淋巴细胞在MTB抗原刺激培养后表达IFN-γ的CD4+T细胞比例显著升高（P<0.001，P<0.001）；感染未治疗组和免疫治疗组表达IL-2的CD4+T细胞比例显著高于正常对照组（P<0.01，P<0.01），半程化疗联合免疫治疗组以及全程化疗联合免疫治疗组该比例分别显著高于相应的半程化疗组和全程化疗组（P<0.001，P<0.001）；各感染组表达IL-4的CD4+T细胞比例总体呈下降趋势；全程化疗联合免疫治疗组表达TNF-α的CD4+T细胞比例显著低于全程化疗组（P<0.001）。各组间表达IFN-γ的CD8+T细胞比例无显著差异，感染未治疗组和免疫治疗组表达IL-2的CD8+T细胞比例显著升高（P<0.001，P<0.001）；半程化疗联合免疫治疗组和全程化疗联合免疫治疗组该比例分别显著高于半程化疗组和全程化疗组（P<0.001，P<0.01）；感染未治疗组和免疫治疗组表达IL-4的CD8+T细胞比例均显著上升，半程化疗联合免疫治疗组该比例高于半程化疗组（P<0.05）；半程化疗组和半程化疗联合免疫治疗组停止化疗后体内荷菌量出现回升但相对缓慢，与感染未治疗组和化疗组相比，相应的免疫治疗组和化疗联用免疫治疗组小鼠脏器荷菌量均无显著差异。结论Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2组合MPLA佐剂的亚单位疫苗可有效刺激感染豚鼠产生抗MTB的特异性抗体，提高豚鼠外周血和脾脏T细胞比例，显著降低感染豚鼠肺脏荷菌量，并且与化疗联合应用后可有效抑制治疗后MTB感染复发。该疫苗能够拮抗MTB感染小鼠模型中化疗所引起的分泌IL-2的CD4+和CD8+T细胞比例的降低，免疫治疗联合化疗可引起表达TNF-α的CD4+T细胞比例降低和表达TNF-α的CD8+T细胞比例升高，但单用免疫治疗或联合化疗对小鼠脏器荷菌量均无显著影响，该疫苗对MTB感染小鼠的免疫治疗效果还需进一步研究。