目的:关节软骨损伤是骨性关节炎的病变基础,关节软骨修复是关节外科领域的研究热点。本研究将补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用后,通过制备相应浓度的含药血清,作用于离体的大鼠膝关节软骨细胞,观察中西医药物的联合应用对软骨细胞的增殖、凋亡及相关蛋白表达的调控作用。再制备大鼠膝关节软骨缺损模型,再将补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用于大鼠,观察大鼠膝软骨损伤修复过程中组织形态学变化、相关基因及蛋白的表达,探索中西医药物联合应用的方式对治疗关节软骨损伤修复的作用价值,为膝关节软骨损伤的修复治疗提供新的理论基础和思路。材料与方法:本实验分为二个部分第一部分:补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨细胞增殖及凋亡影响的研究将SD大鼠(32只)随机分为4组,分别以生理盐水(单纯血清)、补肾壮筋汤(中药血清)、盐酸氨基葡萄糖(西药血清)、补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖(中西结合血清组)对大鼠进行药物灌胃1周,制备相应浓度的含药血清,作用体外培养的大鼠膝软骨细胞(传至4代),通过MTT法检测不同浓度(0.6%、1.2%、2.4%)含药血清对软骨细胞增殖活力、流式细胞分析仪检测细胞凋亡率、Western Blot检测软骨细胞中II型胶原(collagenⅡ)蛋白的表达情况。第二部分:补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用对大鼠膝软骨缺损修复的初步研究将SD大鼠(52只)随机分为4组,A组为生理盐水(空白对照组)、B组为补肾壮筋汤(中药组)、C组为盐酸氨基葡萄糖(西药组)、D组为补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖(中西药联合组)对大鼠进行药物灌胃,通过大体观察、HE染色、扫描电镜分别观察4W、8W、12W大鼠膝软骨缺损修复情况;RT-PCR检测各组collagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因的表达情况;Western Blot检测collagenⅡ蛋白的表达情况。结果:1.体外培养大鼠膝软骨细胞,在倒置显微镜下观察可见细胞大体呈圆球形,贴壁后呈三角形、多角形。传代至第4代时,可以观察到细胞生长速度加快,细胞周边可见具有明显折光性的细胞外基质,细胞呈片状生长,可呈明显的“铺路石”状外观。按照阿尔新蓝染色试剂盒步骤进行染色后,可见软骨细胞多呈多角形,胞质呈均质状,较疏松,大部分可见到核仁,少数也可见分裂相,细胞浆和胞膜呈蓝色,维持表型的稳定。通过MTT法检测软骨细胞增殖结果示:对大鼠膝软骨细胞的促进增殖作用中,中西医结合组优于中药血清组、西药血清组及单纯血清组(P<0.0001),其差异具有统计学意义,分别设置0.6%、1.2%、2.4%含药血清浓度,当中西医结合组含药血清浓度为1.2%时,对软骨细胞的增殖作用最为显著。2.采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡率结果示:中西结合血清组能够明显降低软骨细胞凋亡率,与其他各组比较(P<0.0001),差异具有统计学意义。3.Western Blot检测软骨细胞中collagenⅡ蛋白表达的结果示:中西医结合血清组促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白表达明显高于中药血清组、西药血清组及单纯血清组(P<0.0001),差异具有统计学意义。4.通过大体观察大鼠膝关节软骨缺损4W、8W、12W的修复情况。第4W时,中西药联合组(D组)可见软骨缺损处明显变浅,呈浅凹状,填充物仍为白色纤维组织;中药组(B组)、西药组(C组)可见软骨缺损面积有减小,但没有明显区别,缺损处填充物为白色纤维组织;空白对照组(A组)软骨缺损清晰可见,修复迹象不明显,略有少许纤维组织填充,各组与周边正常关节软骨组织仍有明显区别。第8W时,中西药联合组(D组)软骨缺损基本填平,填充物为类似透明软骨组织,但仍可见缺损印记,股骨髁未见明显骨赘生长;中药组(B组)软骨缺损处凹陷变浅,有白色纤维组织填充,填充物与周边正常关节软骨组织仍有区别,股骨髁周边未见明显骨赘生长;西药组(C组)软骨缺损基本填平,填充物为透明纤维组织,质地较软,股骨髁略变宽,有少许骨赘生长;空白对照组(A组)股骨髁软骨缺损面积有减小,变浅,填充物为少量深色纤维组织,股骨髁内侧髁增宽,有少许骨赘生长。第12W时,中西药联合组(D组)软骨缺损处填平,损伤处关节软骨修复平整、光滑,与周边软骨组织融合为一体;接近正常关节软骨组织;中药组(B组)软骨缺损处基本填平,股骨髁周边有骨赘生长;西药组(C组)软骨缺损处仍可见少许凹陷,填充物为类似软骨组织,缺损表面欠光滑;空白对照组(A组)股骨髁明显呈退行性改变,缺损处较8W时无明显变化,关节软骨表面凹凸不平。大体观察结果初步证明了补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨缺损处的修复效果明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖、生理盐水。5.通过HE染色观察大鼠膝关节软骨缺损4W、8W、12W时组织学变化。第4W时,中西药联合组(D组)软骨缺损处已完全被纤维组织填充,细胞形态有异常,关节软骨表面略有凹陷欠光滑;中药组(B组)软骨缺损处凹陷变浅、软骨表面粗糙不平,纤维组织修复为主,软骨下骨有少许修复;西药组(C组)可见软骨缺损处纤维组织填充,软骨表面粗糙,软骨细胞形态异常,修复组织以纤维组织修复为主;空白对照组(A组)可见软骨缺损处凹陷明显,少许纤维组织修复,软骨表面粗糙不平,细胞形态异常。第8W时,中西药联合组(D组)可见软骨缺损处软骨细胞增殖明显,层次结构清晰,形态接近正常软骨细胞,软骨下骨修复明显,但软骨表面仍有少许缺损;中药组(B组)可见软骨缺损处有少许软骨细胞生长,软骨表面毛糙,软骨下骨有少许修复;西药组(C组)可见软骨缺损处少许软骨细胞生长,纤维组织填充,软骨表面毛糙,软骨下骨有少许修复;空白对照组(A组)可见软骨缺损处未见明显新生软骨细胞,缺损处以纤维组织填充,软骨表面粗糙不平,软骨下骨未见明显修复。第12W时,中西药联合组(D组)可见软骨缺损处软骨修复已接近正常软骨表面,软骨下骨结构修复正常,修复层次清晰可见,软骨细胞形态正常;中药组(B组)可见软骨缺损处凹陷明显变浅,软骨表面欠光滑,新生软骨细胞增殖明显,排列接近正常软骨潮线,软骨下骨修复优于C组;西药组(C组)可见软骨缺损处仍有少许凹陷,修复层次紊乱,可见软骨细胞生长;空白对照组(A组)可见软骨缺损处明显的凹凸不平,软骨表面损伤严重,软骨细胞形态异常,结构层次紊乱。通过HE染色观察大鼠膝软骨组织学变化证明:补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨缺损处的修复从组织形态学上观察明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖、生理盐水。6.通过RT-PCR检测各组4W、8W、12W的collagenⅡ、Aggrecan基因的表达示:第4W、8W、12W时中西药联合组(D组)collagenⅡ基因的表达明显高于中药组(B组)、西药组(C组)、空白对照组(A组)(P<0.001),差异有统计学意义;中药组(B组)与西药组(C组)比较(P>0.05),差异不具有统计学意义;第4W、8W、12W时中西药联合组(D组)Aggrecan基因的表达明显高于中药组(B组)、西药组(C组)、空白对照组(A组)(P<0.001),差异有统计学意义;中药组(B组)与西药组(C组)比较(P>0.05),差异不具有统计学意义。证明了补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖对软骨细胞中collagenⅡ、Aggrecan基因的表达有促进作用,而补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对软骨细胞中collagenⅡ、Aggrecan基因表达的促进作用更为显著。7.通过Western Blot检测各组4W、8W、12W collagenⅡ蛋白的表达情况示:第4W、8W时中西药联合组(D组)collagenⅡ蛋白的表达明显高于中药组(B组)、西药组(C组)、空白对照组(A组)(P<0.001),差异有统计学意义;中药组(B组)与西药组(C组)比较(P>0.05),差异不具有统计学意义。第12W时中西药联合组(D组)collagenⅡ蛋白的表达明显高于中药组(B组)、西药组(C组)、空白对照组(A组)(P<0.001),差异有统计学意义,中药组(B组)与西药组(C组)比较(P<0.001),差异具有统计学意义。证明补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖能够明显促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白的表达,其作用效果明显优于单纯使用补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖。8.通过扫描电镜观察各组软骨缺损微观结构的修复情况,中西药联合组(D组)可见软骨缺损处虽然可见缺损边界,但再生软骨组织表面平坦,基本与周边正常软骨组织融合,结构形态已趋于正常软骨组织;中药组(B组)可见关节软骨缺损处软骨表面有凹陷,损伤的边界仍较清晰,有胶原纤维组织生长;西药组(C组)可见软骨缺损表面较平坦,但较正常软骨组织有明显凹陷,垄沟起伏,损伤表面清晰可见;空白对照组(A组)可见软骨缺损处软骨表面隆起,再生软骨组织呈不规则生长,凹凸不平。证明补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对关节软骨损伤的修复优于其他各组。结论:1.中西医药物联合应用对大鼠膝软骨细胞具有显著的促进增殖作用,降低软骨细胞的凋亡率,显著促进软骨细胞中collagenⅡ蛋白的表达。2.中西医药物联合应用能够更为有效的促进大鼠膝软骨缺损的修复,通过本实验的研究,探索中西医药物联合应用对关节软骨损伤修复的治疗价值,为临床应用奠定了一定的理论基础。