研究背景动脉粥样硬化是诱发心脑血管疾病的重要病理基础,巨噬泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发病早期典型的病理改变。最新研究证实,巨噬细胞的自噬溶酶体活性与胆固醇代谢状况以及泡沫细胞的形成密切相关。因此,调控巨噬细胞的自噬过程,减少巨噬泡沫细胞的形成,成为治疗动脉粥样硬化及相关疾病的核心。近年来,SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰过程,参与胚胎发生发育、肿瘤转移等多种生理病理过程,已成为近年来研究的热点。我们前期研究证实调控自噬溶酶体生成最重要的转录因子TFEB(transcription factor EB)能够发生SUMO化修饰,因此,我们推测TFEB的SUMO化修饰通过调控自噬溶酶体生成参与了巨噬泡沫细胞的形成。目的本研究通过观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬体溶酶体生成的影响,深入探讨其在动脉粥样硬化巨噬泡沫细胞形成过程中的作用及机制。这些研究将有助于进一步了解蛋白质SUMO化修饰及其调控的生物学功能,并进一步了解巨噬泡沫细胞形成的机理及在动脉粥样硬化发生中的作用。方法一、培养THP-1巨噬细胞,给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理24h,应用免疫共沉淀技术检测巨噬细胞TFEB的SUMO化修饰水平的变化。二、运用慢病毒技术构建过表达人TFEB(TFEB)和SUMO化位点突变的TFEB THP-1(TFEB K316R)巨噬细胞株,以空载病毒细胞作为阴性对照组,应用电镜技术观察各组巨噬细胞自噬生成情况;应用免疫荧光技术及western blot检测各组巨噬细胞自噬生成标志lc3的表达情况。三、培养过表达tfeb和sumo化位点突变的tfeb巨噬细胞,以空载病毒细胞作为阴性对照组,应用电镜技术及lysotracker染色观察各组巨噬细胞溶酶体生成情况;应用免疫荧光技术及westernblot检测各组巨噬细胞中溶酶体生成标志lamp1的表达情况。四、培养过表达tfeb和sumo化位点突变的tfeb巨噬细胞,以空载病毒细胞作为阴性对照组,应用实时荧光定量pcr的方法检测各组巨噬细胞tfeb下游靶基因(自噬及溶酶体生成相关基因)的表达情况。五、培养过表达tfeb和sumo化位点突变的tfeb巨噬细胞,以空载病毒细胞作为阴性对照组,给予ox-ldl处理24h,通过荧光分光光度计检测各组巨噬细胞总胆固醇(tc)、胆固醇酯(ce)含量及胆固醇酯水解率;用液体闪烁计数法检测各组巨噬细胞胆固醇流出率;六、培养过表达tfeb和sumo化位点突变的tfeb巨噬细胞,以空载病毒细胞作为阴性对照组,给予ox-ldl处理24h,应用油红o及nilered染色观察各组巨噬细胞泡沫细胞形成情况。结果一、在巨噬泡沫细胞形成过程中,tfeb的sumo化修饰水平的改变培养人thp-1巨噬细胞,我们检测到了内源性tfeb的sumo化修饰条带。并且,给予50μg/mlox-ldl刺激24h后,发现tfeb的sumo化修饰水平较对照组明显降低,说明在ox-ldl诱导巨噬细胞泡沫化过程中,tfeb的sumo化修饰水平受到显著抑制。二、tfeb的sumo化修饰对巨噬细胞自噬的影响电镜结果显示:与对照组相比,tfeb组巨噬细胞内自噬体的数量明显增加,而tfebk316r组巨噬细胞内自噬体的数量明显较tfeb组显著减少(均p<0.05)。并且,tfeb组巨噬细胞内自噬生成标志lc3的蛋白表达量较tfebk316r组显著明显增加。这些结果说明tfeb的sumo化修饰促进巨噬细胞自噬。三、tfeb的sumo化修饰对巨噬细胞溶酶体生成的影响电镜和lysotracker染色结果显示:与对照组相比,tfeb组巨噬细胞溶酶体数量增多(p<0.05),体积增大;而tfebk316r组巨噬细胞内溶酶体数量和体积较对照组无明显差异。并且,tfeb组巨噬细胞溶酶体生成标志lamp1的蛋白表达量较tfebk316r组明显增加。这些结果说明tfeb的sumo化修饰促进巨噬细胞溶酶体的生成。四、tfeb的sumo化修饰对tfeb下游自噬及溶酶体生成基因表达的影响与对照组相比,过表达tfeb明显增加巨噬细胞自噬(lc3,ulk1,wip1,atg9b,becline1)和溶酶体(lamp1,ctsb,clcn7,atp6v1a)生成相关基因的表达,但是tfebk316r组内自噬溶酶体生成相关基因的表达量较tfeb组明显降低(均p<0.05)。这些结果说明tfeb的sumo化修饰促进巨噬细胞自噬及溶酶体生成相关基因的表达。五、tfeb的sumo化修饰对巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响与对照组相比,tfeb组巨噬细胞内tc和ce含量明显降低,胆固醇酯水解程度显著增加,apoa-i介导的胆固醇流出增多(均p<0.05);而tfebk316r组巨噬细胞内tc和ce含量较tfeb组明显增加,胆固醇酯水解程度显著降低,apoa-i介导的胆固醇流出减少(均p<0.05)。这些结果说明tfeb的sumo化修饰促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解,增加胆固醇的流出。六、tfeb的sumo化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响油红o及nilered染色结果显示:与对照组相比,tfeb组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成明显减少;而tfebk316r组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较tfeb组显著增多,这些结果说明,tfeb的sumo化修饰抑制了巨噬泡沫细胞的形成。结论一、在ox-ldl诱导巨噬细胞泡沫化过程中,tfeb的sumo化修饰水平明显降低,初步明确tfeb的sumo化修饰与巨噬泡沫细胞形成的关系。二、TFEB的SUMO化修饰通过增加自噬与溶酶体生成相关基因的表达,诱导巨噬细胞溶酶体的生成和自噬过程。三、TFEB的SUMO化修饰通过促进巨噬细胞脂质水解,促进胆固醇的流出,最终减少泡沫细胞的形成。