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目的酵母双杂交筛选出与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的CAMK1G,并验证CAMK1G和Pkmyt1存在相互作用,进而研究其对小鼠受精卵早期发育的影响,为蛋白激酶Pkmyt1在哺乳动物胚胎发育中的信号转导通路研究奠定基础。方法1、根据小鼠Pkmyt1（Genebank ID:NM023058）序列,设计合成引物,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒。2、复苏酵母菌,制备感受态细胞,将p GBKT7-Pkmyt1转入酵母感受态细胞,检测其对酵母是否具有毒性和自身激活能力,蛋白免疫印迹实验检测其在酵母细胞中是否有表达。3、利用酵母双杂交技术从人卵巢c DNA文库中筛选出与Pkmyt1相互作用的蛋白。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,筛选出阳性克隆,挑取克隆进行扩大培养,提取阳性克隆的酵母质粒,转化大肠杆菌感受态细胞,测序鉴定,重新转化酵母感受态细胞,验证其是否有自激活能力。4、构建pc DNA3.1-flag-Pkmyt1与pc DNA3.1-Myc-CAMK1G质粒,转染至NIH3T3细胞,免疫共沉淀验证CAMK1G和Pkmyt1在细胞内存在相互作用。5、实时荧光定量PCR检测小鼠1-细胞期受精卵中Pkmyt1 m RNA的表达水平。6、免疫荧光观察Pkmyt1和CAMK1G在小鼠1-细胞期受精卵的共定位情况。结果1、成功构建诱饵质粒p GBKT7-Pkmyt1。2、诱饵质粒p GBKT7-Pkmyt1对酵母感受态细胞无毒性,无自激活能力,蛋白免疫印迹实验验证其在酵母细胞中有表达。3、酵母双杂交筛选出与蛋白激酶Pkmyt1存在相互作用的蛋白共46个。4、免疫共沉淀结果表明蛋白激酶Pkmyt1与CAMK1G在细胞内存在相互作用。5、实时荧光定量PCR检测到蛋白激酶Pkmyt1在小鼠1-细胞期受精卵各个时期均有m RNA表达,且呈现先增高后降低的变化趋势,即G1期表达较低,S期明显增多,G2较S期表达少,M期表达最低。此趋势提示PKmyt1在小鼠1-细胞期受精卵各个时期的m RNA表达水平与受精卵的有丝分裂有关。6、免疫荧光观察到蛋白激酶Pkmyt1和CAMK1G在小鼠1-细胞期受精卵中存在共定位。结论本研究利用酵母双杂交系统筛选出与蛋白激酶Pkmyt1存在相互作用的候选分子46个,其中免疫共沉淀证实CAMK1G与Pkmyt1存在相互作用,且Pkmyt1的m RNA在小鼠受精卵各个时期动态表达,Pkmyt1和CAMK1G在1-细胞期受精卵中共定位,提示蛋白激酶Pkmyt1可能通过与CAMK1G相互作用进而调控小鼠受精卵的早期发育。