研究背景心绞痛(angina pectoris)是由于冠状动脉供血不足,心肌急剧的暂时缺血与缺氧所引起的临床综合征,以发作性胸痛或胸部不适为主要症状。稳定型心绞痛是一种常见的致残性疾病,在中国患病率为3.6%,来自文献的数据报告显示,在美国,心绞痛的发病率为每年每千人中有12.3例(年龄为45-74岁),其中60岁以上的男性患病率为20%,并且欧洲也有类似报导,稳定性心绞痛患者的年死亡率为1.2-2.4%,这给卫生保健系统带来了巨大的负担。在过去的15年中,有效的治疗方法包括经皮冠状动脉介入术(PCI)或冠状动脉旁路移植术(CABG)和抗心绞痛药物,但是PCI术后出现的并发症包括晚期血栓、无复流现象、远期事件等,表明介入治疗后仍需强化药物治疗。在我国,中医药被广泛应用于冠心病心绞痛的治疗,尤其在缓解症状、减少术后并发症、改善远期终点事件等方面有一定的优势。2019年11月中华中医药学会心血管病分会发布了《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗指南》,为临床中医药规范应用提供支持。过去的药物研究模式以“单靶点”为主,而表型的鲁棒性和网络的系统性表明了单靶点研究模式的弊端,中药具有“多成分、多靶点”的特征,网络药理学的发展为研究中药组分的机制提供了新的理念和策略。生物系统表现出模块化的组织,从模块层次可以更为精准的研究药理机制。与单一药物相比,高阶的合理扰动更容易产生治疗效果,而高阶的模块阵列可以识别药物的协同机制。因此,模块的的转变及重构是对不同的干扰所做出的适应性调整,不同状态下模块间的差异可能是药物协同作用机制的体现。研究目的本研究基于丹红注射液干预前后以及干预后不同时间点网络模块数据,构建一种量化模块间差异度的方法,筛选出丹红治疗有效人群的有效重构模块,探索丹红注射液的药理作用机制,为丹红注射液临床精准化应用提供依据。研究方法本研究使用丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛的临床研究结果,以基因芯片数据和加权基因共表达网络以及模块为前提,首先通过统计学方法(非参数检验、共线性诊断、判别分析)识别出对模块比较具有特异性的拓扑指标,并结合节点&边从多维角度构建量化模块间差异度的方法;其次根据丹红或基础干预后有效人群和无效人群的模块对比较,以无效人群组模块对差异度的最大值作为阈值,识别出不同干预措施下有效人群的有效重构模块;第三,对各组有效重构模块进行GO功能富集和分类、以及KEGG通路分析;最后,采用典型相关分析(CCA)计算丹红有效重构模块与表型的相关性,验证通过量化模块间的差异识别有效重构模块方法的可行性,以及此方法用于探索慢性稳定性心绞痛模块靶标的有效性。研究结果1 拓扑参数的筛选以健康组和疾病组网络模块为基础,通过使用多种统计学方法筛选具有特异性和敏感性的拓扑指标,最终网络半径(Network radius)被纳入模块间差异比较的方法中;2 量化模块间差异度方法的确立通过VEO的方法计算健康组和疾病组网络模块对间节点和边的差异度,并结合欧氏距离计算模块对间网络半径的差异度,采用熵值法进行赋权,从多维角度综合量化模块对间的差异度,其中节点&边差异度,网络半径差异度的权重分别为:0.59,0.41;3 有效重构模块的识别通过各组有效人群、无效人群分别与疾病组模块对的的差异度计算,以各组无效人群与疾病组模块对差异的最大值为阈值,筛选各组有效人群的有效重构模块,结果发现丹红治疗14天有效人群组、丹红治疗30天有效人群组、基础治疗(对照组)14天有效人群组、基础治疗(对照组)30天有效人群组的有效重构模块分别为6、4、3、4个;有效人群与疾病组模块对的平均差异度均大于无效人群;此外,以对照组与疾病组模块对差异的最大值为阈值识别出2个丹红治疗纯的有效重构模块;4 GO功能和KEGG通路分析通过对各组有效重构模块的GO功能富集分类发现,丹红14天有效重构模块、丹红30天有效重构模块、对照14天有效重构模块、对照30天有效重构模块、丹红14天纯的有效重构模块、丹红30天纯的有效重构模块分别有22、23、22、2、7、10种类别,表明不同治疗状态以及不同治疗时间条件下的GO功能分类具有多样性;丹红组有效重构模块的KEGG通路之间具有共同特征,特异性的通路同时调节了 MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、NF-κB signaling pathway,且通路都与冠心病心绞痛的病理机制相关;5 有效重构模块与表型的相关性计算通过丹红组有效人群有效重构模块与表型相关性分析得出,black模块以及magenta模块均与心绞痛发作频率的缓解、躯体活动受限程度的缓解,心绞痛的稳定性的程度,治疗的满意度,生活质量的改善均呈强相关性,magenta模块与中医证候积分改善情况呈强相关性,black模块与症状改善呈强相关性,同时文献验证了大多数节点均与冠心病相关。结论1 通过结合节点&边以及拓扑指标(网络半径)计算模块间的差异度,并使用熵值法赋权,确定了最优的量化模块间差异度的方法,此方法对于筛选有效重构模块具有可行性。2 丹红治疗有效人群有效重构模块的GO功能分类呈多样化特征,其中代谢是其调控的主要方向;丹红有效重构模块富集的通路之间有共同的调控路径,包括MAPK signalingpathway、PI3K-Aktsignalingpathway、NF-κB signalingpathway,体现了丹红治疗慢性稳定性心绞痛的多靶点、多通路机制。3 丹红有效重构模块与多表型间的强相关性印证了量化模块间差异筛选有效重构模块方法的可靠性;模块药理机制分析表明DHI治疗慢性稳定性心绞痛有效人群的机制主要与抗血小板聚集、抗炎相关。4 量化模块间差异筛选有效重构模块的方法为从网络或模块角度探索多靶点药物治疗复杂疾病(如慢性稳定性心绞痛)的药理机制提供新的分析方法和思路。