骨组织对外界刺激特别敏感,能够感受到各种化学和力学信号的刺激。成骨细胞的形态、分化和增殖均与力学刺激有关。当机械外力作用于骨组织时,成骨细胞处于组织的应力环境中,应力刺激细胞膜并通过微丝和微管传递到细胞核,应力信号在传递过程中引起一系列生化反应,从而刺激成骨细胞内各种成骨分化相关基因的表达,影响骨的形成及改建。目前有关各种应力环境下成骨效应的研究虽然较多,但大部分为牵张力及流体剪切力对骨组织或成骨细胞的影响,而压力对成骨细胞刺激的研究多采用静态压力模式,且为持续静态压力,关于动态压力刺激对骨组织的作用效应较少报导。近年来研究发现Ca2+、K+、Cl–等离子通道均与成骨细胞的分化有关,其中CLC型氯通道是最重要的一种阴离子通道,它的突变和功能异常可引起多种疾病。CLC-3型氯通道是电压门控型氯通道之一,可参与调节细胞容积、细胞增殖、细胞分化及凋亡等。研究表明CLC-3基因促进成骨细胞分化与Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)有关。转录相关因子Runx2是成骨细胞分化的重要因子,它参与多种细胞内外信号的传递,其中BMP-2-Smads-Runx2信号通路在外界刺激成骨细胞分化中发挥重要作用。在成骨细胞分化过程中,多种成骨细胞特异性基因如骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Runx2、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)等成骨分化相关基因陆续表达,分泌到细胞外基质中,调控细胞外基质的矿化,逐步完成机体内骨组织的形成。最近研究发现一定时间和大小的静态压力刺激能引起成骨细胞内CLC-3表达的增加,并促进成骨细胞的分化,但应用Flexcell细胞加压系统研究周期性动态压力对成骨细胞CLC-3离子通道的影响及其机制尚未见报导。本课题应用Real-time PCR及Western blot等方法分三部分研究周期性动态压力对成骨细胞CLC-3的影响及其机制。第一部分:周期性动态压力对成骨细胞CLC-3离子通道及成骨分化相关基因表达的影响;第二部分:Chlorotoxin对成骨细胞CLC-3离子通道及成骨分化相关基因加压后表达的影响;第三部分:周期性动态压力对CLC-3离子通道及成骨细胞增殖相关基因表达的影响。第一部分周期性动态压力对成骨细胞CLC-3离子通道及成骨分化相关基因表达的影响目的:观察周期性动态压力对成骨细胞MC3T3-E1超微结构的影响;探讨周期性动态压力对成骨细胞CLC-3离子通道及成骨分化相关基因BMP-2、Runx2及OPN表达的影响。方法:自中科院上海细胞库购置小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1,于12孔板(含有10%FBS及50μg/ml抗坏血酸的培养基)内培养,在第14天时加入2m M的β-甘油磷酸钠,连续培养至28天,形成约1-2mm厚的3D细胞膜。将细胞分为实验组及对照组,实验组:收集3D细胞膜,并用吸管放入到Biopress培养板的培养孔中,每个培养孔加入1.5ml含5%FBS,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和4m M谷氨酰胺的CO2敏感性培养基(Invitrogen公司,法国)。利用生物力学加载系统(Flexcell公司,美国)分别对各培养孔中的细胞膜加载压力,加力等级为30Kpa,频率为1Hz,1/2的正弦波形压力下加载2、4、8h。压力加载后,取出该3D细胞膜,IV型骨胶原酶消化并分离3D膜中的成骨细胞备用(3mg/ml,37℃条件下搅拌30min)。应用透射电镜观察周期性动态压力条件下MC3T3-E1细胞超微结构的变化;采用Real-time PCR法检测CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN m RNA的表达;Western blot方法检测CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN蛋白的表达。对照组:细胞不加压,余处理同实验组。结果:经透射电镜观察MC3T3-E1细胞,可见加压前细胞表面少量突起,细胞质内可见少量线粒体、粗面内质网及高尔基体等细胞器。加压2h后,细胞表面突起轻度增加,线粒体、粗面内质网及高尔基体等细胞质内的细胞器轻度增加。加压4h后,细胞表面突起明显增多,核仁变明显,胞核位于细胞的一侧,胞浆中可见散在丰富的溶酶体及糖元,胞核周围可见较多的粗面内质网、高尔基复合体及散在的椭圆形线粒体。加压8h后,细胞较加载4h细胞表面突起略有增多,高尔基复合体、粗面内质网和线粒体也进一步增多。对照组2、4、8h后CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN m RNA及蛋白均无明显变化(P>0.05)。与对照组比较,动态压力加载MC3T3-E1细胞2、4、8h后,细胞内CLC-3及成骨分化相关基因BMP-2、Runx2及OPN在m RNA及蛋白水平均明显上调(P<0.05)。第二部分Chlorotoxin对成骨细胞CLC-3离子通道及成骨分化相关基因加压后表达的影响目的:观察Chlorotoxin(Cltx,CLC-3特异性阻滞剂)阻断CLC-3离子通道后周期性动态压力对MC3T3-E1细胞中CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因表达的影响。方法:3D细胞膜的制备及细胞提取同第一部分。为研究加入Chlorotoxin后,细胞加压后CLC-3及成骨细胞分化相关基因BMP-2、Runx2及OPN的表达变化,我们将实验分为两组。1实验组一:细胞加压且不加Cltx组。MC3T3-E1细胞经过30Kpa,频率为1Hz,1/2正弦波形的动态压力8h后,取出3D细胞膜,IV型骨胶原酶消化并分离3D细胞膜中的细胞,应用Real-time PCR及Western blot方法检测CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因m RNA及蛋白的表达。2实验组二:细胞加压且加入Cltx组。细胞加压前30分钟应用Cltx阻断CLC-3离子通道,然后给予加力等级为30Kpa,频率为1Hz,1/2的正弦波形动态压力培养MC3T3-E1细胞8h后,Real-time PCR及Western blot方法检测CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因m RNA及蛋白的表达。结果:与加压不加Cltx组比较,应用Cltx阻断CLC-3离子通道周期性动态压力条件下培养MC3T3-E1细胞8h后,CLC-3 m RNA和蛋白的表达无明显降低(P>0.05),而BMP-2、Runx2及OPN基因m RNA和蛋白的表达均明显下降,结果有统计学差异(P<0.05)。第三部分周期性动态压力对CLC-3离子通道及成骨细胞增殖相关基因表达的影响目的:检测成骨细胞MC3T3-E1经过不同时间周期性动态压力作用后细胞内CLC-3离子通道及增殖相关基因PCNA及Ki67 m RNA及蛋白的表达,并探讨其相关性。方法:3D细胞膜的制备及细胞提取同第一、二部分。将细胞分为实验组及对照组,实验组:收集3D细胞膜,并用吸管放入到Biopress培养板的培养孔中,每个培养孔加入1.5ml含5%FBS,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和4m M谷氨酰胺的CO2敏感性培养基(Invitrogen公司,法国)。利用生物力学加载系统(Flexcell公司,美国)分别对各培养孔中的细胞膜加载压力,加力等级为30Kpa,频率为1Hz,1/2的正弦波形压力下加载2、4、8h。压力加载后,取出3D细胞膜,IV型骨胶原酶消化并分离3D膜中的成骨细胞(3mg/ml,37℃条件下搅拌30min)。Real-time PCR检测CLC-3及增殖相关基因PCNA及Ki67 m RNA的表达,Western blot法检测CLC-3、PCNA及Ki67蛋白的表达。对照组:细胞不加压,余处理同实验组。结果:对照组2、4、8h后CLC-3、Ki67及PCNA m RNA及蛋白均无明显变化(P>0.05)。与对照组比较,动态压力作用于成骨细胞MC3T3-E1细胞2、4、8h后CLC-3基因在m RNA及蛋白水平表达均明显增加(P<0.05),成骨细胞增殖相关基因PCNA及Ki67在m RNA及蛋白水平上无明显变化(P>0.05)。结论:1周期性动态压力可促进CLC-3表达,增加细胞膜表面CLC-3离子通道的数量。2伴随CLC-3表达的增加,BMP-2,Runx2及OPN的表达也相应增加,成骨细胞分化可能与CLC-3型氯通道有关。3周期性动态压力可上调成骨细胞分化相关基因BMP-2、Runx2及OPN的表达,促进成骨细胞的分化。4 CLC-3离子通道特异性阻滞剂Cltx不影响成骨细胞CLC-3基因的表达,但可减少有功能的CLC-3离子通道的数量。5 CLC-3基因促进成骨细胞分化是通过有功能的CLC-3离子通道实现的。6成骨分化相关基因BMP-2、Runx2及OPN的表达与有功能的CLC-3离子通道数量有关。7在30Kpa,频率为1Hz,1/2的正弦波形动态压力下加压2、4、8h后对成骨细胞的增殖活性无明显影响。8在30Kpa,频率为1Hz,1/2的正弦波形动态压力下加压2、4、8h后,CLC-3基因的表达与成骨细胞增殖相关基因Ki67及PCNA无明显相关性。