抗病毒活性糖苷的筛选及其对TLR3及相关基因的调控

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很多植物多糖具有广泛的生物活性。糖苷类化合物是糖类的衍生物,作为一类安全低毒、不易在生物体内残留的重要中药成分,不仅能增加机体的免疫功能,且具有极广泛的抗病毒活性作用。养鸡业在我国的养殖行业占有非常重要的比例,然而禽病的发生一直制约着养鸡业的发展,尤其是病毒性疾病,如高致病性禽流感、新城疫、传染性法氏囊病等。研究发现,在禽类抗病毒免疫过程中,Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)发挥着重要的抗病毒作用,其中TLR3位于细胞内,可特异性识别病毒dsRNA结构,包括:dsRNA病毒的核酸,ssRNA病毒在复制过程中产生的dsRNA以及DNA病毒侵袭宿主细胞后在表达及增殖的过中产生的RNA片段。本文旨在以传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)感染鸡胚成纤维细胞系(DF1)为模型,进行抗病毒活性糖苷的筛选,并对其调控TLR3及相关基因的作用进行研究。本试验选择了10种糖苷:黄芩苷、人参苷、橄榄苦苷、栀子苷、柚皮苷、根皮苷、红景天苷、黄芪多糖、人参多糖、云芝糖肽。采用MTT法分别检测了10种糖苷对DF1细胞的毒性作用,从而确定了最大无毒浓度和半数细胞毒性浓度(CC50)。将最大无毒浓度范围内不同剂量的候选糖苷与100TCID50病毒同时作用于DF1细胞,结合MTT法以及CPE法,测定了糖苷的抗病毒作用。发现黄芩苷和橄榄苦苷对IBDV的最大抑制率(MIR)均>70%,治疗指数(TI)均>4,表明二者可显著抑制病毒感染。进一步的研究表明黄芩苷和橄榄苦苷在病毒的阻滞试验(预处理3天)和复制抑制试验中最高抑制率均>58%,且黄芩苷和橄榄苦苷对病毒没有直接灭活作用,不是抑制IBDV对DF1细胞吸附及穿入,因此黄芩苷和橄榄苦苷可进入细胞内发挥抗病毒作用。本研究进一步通过荧光定量PCR检测到黄芩苷和橄榄苦苷在作用于IBDV感染的DF1细胞8h和12h时,能在不同程度上调节TLR3的表达,表明二者能通过对TLR3的调节发挥抗IBDV的作用。将黄芩苷和橄榄苦苷直接作用于DF1细胞后,发现二者可以微弱上调TLR3和IFN-β的表达。在此基础上,Poly(I:C)转染的DF1细胞可以高水平表达TLR3、TRIF、IFN-β,而应用黄芩苷和橄榄苦苷却可以显著的下调这些高表达的基因转录水平。因此,黄芩苷和橄榄苦苷可以同过对TLR3及相关基因的调节发挥抗病毒作用。本研究首次以可以激活TLR3信号通路的IBDV来筛选具有抗病毒活性的糖苷,并对糖苷的抗病毒作用机制进行了深入研究,为活性糖苷应用于鸡病毒性疾病的防治奠定了理论基础,提供了实验依据。
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