胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)包括IGF1、IGF2,是一类与胰岛素前体有40%同源性的细胞增殖调控因子。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF binding protein, IGFBP)是一个包含六个具有高度同源性、与IGF有高亲和力蛋白成员的家族。IGF、IGFBPs及其相关蛋白构成一个复杂的分子网络,该分子网络包括两个主要的配体(IGF1和IGF2),细胞表面受体(IGF1R,IGF2R和IR)及IGFBPs,还包括一系列水解IGFBPs的蛋白酶,这些酶对IGFBPs的水解作用可以调节其与IGF的相互作用。最近几年的研究,又有新的成员加入,包括胰岛素受体相关蛋白(insulin receptor-related protein, IRR)、几个IGFBP相关蛋白(IGFBP-related protein, IGFBP-rP)。胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7, IGFBP7)是我们实验室通过抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)从结肠腺癌-正常粘膜的差减cDNA文库中筛出,并在结肠腺癌中高表达的一个基因,又称做胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein 1,IGFBP-rp1)。我们实验室一直致力于该基因在结直肠癌中功能的研究,发现IGFBP7在结直肠癌中可能是一个侯选抑癌基因,同时,我们还发现结直肠癌病人空腹血糖与结直肠癌组织IGFBP7的表达水平呈正相关。国外也有报道发现未经治疗的2型糖尿病患者有明显的外周血IGFBP7聚集现象,可推测IGFBP7是一个与结直肠癌、糖尿病都相关的重要基因。与IGFBP1-6相比,IGFBP7与胰岛素结合能力相对于IGF的结合能力是IGFBP1-6的500倍,预示着IGFBP7与胰岛素的结合是引起胰岛素抵抗的原因之一,因此进行IGFBP7与胰岛素的结合相关方面的研究具有极为重要的意义。本实验以IGFBP7与胰岛素的高亲和力为研究的切入点,与浙江大学计算化学专业实验室合作,借助计算化学的优势,将同源建模、docking分析、相互作用能量曲线分析、高通量分子场建模等方法有机地结合起来,预测出IGFBP7与胰岛素的结合区域主要包括四个结构域：AA172-176,AA196-201,AA217-220,AA235-244。根据上述结果设计并构建了蛋白表达载体后,原核表达IGFBP7与六个His的融合蛋白,并定性地检测它们与胰岛素的结合能力,发现IGFBP7的羧基末端是与胰岛素结合的相关结构域,很好的验证了上述的预测结果。在此基础之上,我们进一步计算模拟两个大分子的结合状态,在C末端更为精确的定位与胰岛素发生直接相互作用的关键氨基酸位点。在结合状态的拉伸模拟过程中找出结合最强的几个氨基酸残基,然后在尽量不改变空间结构和氨基酸残基空间体积的原则下进行模拟突变实验,发现当第198位的Arg和第200位的His发生相应的突变,突变成Ilel98、Phe200时,IGFBP7与胰岛素的结合能力最差,而这两个氨基酸残基单独突变时,结合能力的下降没有发生很大变化。我们在上述预测基础之上,在野生型IGFBP7 (W)的表达载体上引入定点突变,构建突变蛋白表达载体,原核表达纯化得到突变蛋白：Arg198→Glu198(M1),His200→Phe200(H200F),Arg198/His200→I1e198/Phe200(M2)。然后用免疫印记和pull down的方法定性检测他们与胰岛素的结合能力。通过实验我们初步证明,IGFBP7蛋白分子的C末端Arg198与His200是与胰岛素结合的关键氨基酸位点,因为将这两点同时突变的蛋白与胰岛素的结合能力有明显下降。这些都为将来设计药物干扰IGFBP7与胰岛素的结合,治疗胰岛素抵抗提供思路,也为研究IGFBP7的生物学效应奠定了坚实的基础。通过以上我们关于IGFBP7蛋白与胰岛素结合关键位点的预测以及验证研究,可得出以下结论：1.借助交叉学科的优势,通过将同源建模、docking分析、相互作用能曲线分析、高通量分子场建模等方法,可以准确预测出蛋白相互作用的结合位点。2.构建突变蛋白表达载体,原核表达纯化出的蛋白质结构未发生较大改变,可以用于与胰岛素的结合研究。3. IGFBP7与胰岛素的关键结合位点为其分子C末端的第198位精氨酸、第200位组氨酸,将这两个氨基酸同时突变的蛋白与胰岛素的结合能力明显降低。