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目前,糖尿病因其逐年增长的患病率及急、慢性并发症,已经成为严重的公共健康问题,而骨质疏松被称为“沉默的杀手”,目前已成为中老年人骨痛、骨折及致残、致死的主要原因之一。糖尿病患者骨形成与骨吸收之间平衡的打破可能是导致其骨折风险增加的主要原因。骨通过破骨细胞、成骨细胞不断重塑,而破骨细胞是执行骨吸收功能的唯一的细胞。同成骨细胞一样,正常数量与活性的破骨细胞对于正常的骨转换是至关重要的,最近一些研究表明,高糖抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成。在许多1型糖尿病研究中,破骨细胞表现为数量减少、活性下降,2型糖尿病研究中亦发现破骨细胞功能受抑制。高糖可能通过抑制破骨细胞分化,打破骨转换的平衡。目前,高糖对破骨细胞的影响亦存在一定争议,糖尿病领域尚无研究指向参与破骨细胞分化的重要转录因子及调节因子。破骨细胞的分化依赖成骨细胞产生的细胞核因子KB受体活化因子配基(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligands, RANKL)与破骨细胞前体细胞膜上的细胞核因子KB受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B, RANK)相互作用活化的多种转录因子和信号通路调节。RANKL促进破骨细胞前体分化需要先后表达核因子-κB (Nuclear factor Kappa B, NF-κB)、c-Fos、活化T细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T-cells,NFATc1), c-fos是NFATc1的上游调节因子,其与NFATc1共同调控破骨细胞的分化。RANKL能诱导破骨细胞形成过程中破骨细胞质子泵亚单位(v-ATPase V0subunit d2,Atp6v0d2)和树突状细胞-特异性跨膜蛋白(dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP)的表达,NFATc1通过Atp6v0d2和DC-STAMP上调破骨细胞前体细胞间的融合,促进破骨细胞的分化该论文通过研究高糖对破骨细胞分化的影响及对参与破骨细胞分化的主要转录因子c-fos、NFATc1及调控破骨细胞融合的重要分子ATP6vOd2、DC-STAMP的表达的影响,进一步探索高糖是否抑制破骨细胞的分化及其具体调控机制。第一部分高糖对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响目的：本文以小鼠单核细胞株RAW264.7细胞作为破骨细胞前体细胞,应用小鼠重组RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化。本部分拟探讨高糖对RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响方法：以RAW264.7细胞为研究对象,依据不同浓度葡萄糖培养基及是否给予RANKL干预设定未处理组(葡萄糖5.6mmol/L,无RANKL),对照组(葡萄糖5.6mmol/L+RANKL),高糖组(葡萄糖20.2mmol/L+RANKL),渗透压控制组(葡萄糖5.6mmol/L+14.6mmol/L甘露醇+RANKL).RAW264.7细胞以2×104/孔的密度接种于24孔板,12小时后对照组、高糖组、渗透压控制组加入100ng/ml小鼠重组RANKL,诱导培养4天后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色,以细胞核≥3的TRAP阳性多核细胞作为破骨样细胞,进行计数,比较高糖与正常浓度葡萄糖培养条件下,RANKL诱导的的破骨样细胞数量的差异。同时RAW264.7细胞以5x103/孔的密度接种于96孔板,应用不同浓度葡萄糖培养基(5.6mmol/L.15.3mmol/L.20.2mmol/L)培养,检测细胞增殖率结果：RANKL能诱导TRAP阳性多核细胞形成,与对照组相比,高糖组TRAP阳性多核细胞形成明显降低(P<0.01),渗透压控制组与对照组TRAP阳性多核破骨样细胞数量差异无统计学意义。而细胞增殖检测示高糖促进RAW264.7细胞增殖。应用方差分析分析组间差异。结论：高糖明显抑制RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化第二部分高糖对RANKL诱导的ATP6v0d2、 DC-STAMP表达及相关转录因子的影响目的：破骨细胞前体细胞间的融合是破骨细胞分化形成的关键环节,多核破骨细胞的形成保证了破骨细胞的骨吸收功能。本部分拟通过检测RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中ATP6vOd2.DC-STAMP等破骨细胞融合介导因子及其上游转录调控因子c-fos、NFATc1的基因及蛋白表达,探讨高糖是否通过影响破骨细胞前体细胞间的融合而抑制破骨细胞的分化、成熟,同时涉及转录调控因子的变化,分析高糖影响破骨细胞分化的具体机制。方法：以RAW264.7细胞为研究对象,同第一部分,依据不同浓度葡萄糖培养基及是否给予RANKL干预设定未处理组(葡萄糖5.6mmol/L,无RANKL),对照组(葡萄糖5.6mmol/L+RANKL),高糖组(葡萄糖20.2mmol/L+RANKL),渗透压控制组(葡萄糖5.6mmol/L+14.6mmol/L甘露醇+RANKL).RAW264.7细胞以1x105／孔的密度接种于6孔板,12小时后对照组、高糖组、渗透压控制组加入100ng/ml小鼠重组RANKL,诱导培养5天后提取总RNA,反转录后行荧光定量PCR,检测ATP6vOd2、DC-STAMP、c-fos、 NFATcl mRNA表达。RAW264.7细胞仍以1x105／孔的密度接种于6孔板,12小时后对照组、高糖组、渗透压控制组加入100ng/ml小鼠重组RANKL,诱导培养5天后应用核蛋白提取试剂提取细胞核蛋白,蛋白浓度定量后行Western blot检测,进行c-fos、NFATc1等蛋白相对定量。结果：荧光定量PCR结果显示,高糖组RANKL诱导的转录因子c-fos、NFATc1基因表达较对照组明显降低(P<0.05、p<0.01),同时高糖组ATP6v0d2、DC-STAMP基因表达亦较对照组明显降低(p<0.01、p<0.01),渗透压控制组与对照组c-fos、NFATc1的基因表达及ATP6vOd2、DC-STAMP的基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明,高糖组RANKL诱导的转录因子c-fos、NFATc1蛋白表达较对照组明显降低(P<0.05、P<0.05),渗透压控制组与对照组c-fos、NFATc1的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：高糖明显抑制RANKL诱导c-fos、NFATc1等转录因子的表达,同时抑制ATP6vOd2、DC-STAMP等破骨细胞融合介导因子的表达,从而抑制破骨细胞的多核化及成熟、活化,进而影响破骨细胞的功能。