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由对虾白斑综合征病毒(WSSV)引起的对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害最大,传播最广的病害之一,至今已席卷了世界上主要的对虾养殖地区,造成了巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。大量研究已经表明囊膜蛋白VP28与WSSV的系统感染有关,但对VP28蛋白具体发挥作用的功能位点尚不清楚。本研究主要通过对VP28蛋白进行不同结构域的缺失表达,研究各结构域对WSSV系统感染的作用。主要研究内容和结果如下:
1)通过设计特异性引物扩增得到三种不同结构基因缺失的重组VP28基因,并在大肠杆菌中进行表达,经过柱纯化后,分别用SDS-PAGE和Western-blot进行蛋白分析。结果表明,三组蛋白:疏水域缺失重组表达蛋白(VP28N),糖基化位点集中区缺失重组表达蛋白(VP28C),抗原决定簇集中区缺失重组表达蛋白(VP28M),在大肠杆菌中进行了有效的表达,各重组蛋白大小分别为35.4kDa、38.5kDa、41.3kDa。
2)各重组表达蛋白VP28C、VP28N、VP28M和VP28经超滤膜过滤除菌后,与弗氏佐剂进行乳化,采取背部皮下多点注射的方法免疫兔子,经3-4次免疫之后,获得分别抗四种重组蛋白的多克隆抗体血清。对多抗血清进行ELISA和Western-blot分析,结果显示,四种多抗血清都有较高的抗体效价,且特异性识别程度高。
3)以克氏原螯虾为实验模式动物,进行了四种重组蛋白在虾上对WSSV的免疫保护试验,四种重组蛋白的多克隆抗体与WSSV的中和试验。免疫试验表明,四种蛋白在免疫螯虾后均能提高螯虾抗WSSV感染的能力,其中VP28C的免疫保护率达到了53.85%,免疫保护作用最为明显;中和试验结果表明,四种蛋白的多克隆抗体均能不同程度抑制WSSV的感染能力,并以VP28C蛋白的多抗效果最好。在体外培养的螯虾血细胞后进行体外中和试验结果也表明VP28C多抗中和WSSV的效果最好。分析表明在WSSV感染细胞过程中囊膜VP28的主要功能结构域在VP28C内,即VP28蛋白与细胞膜作用的主要功能结构域位于其预测的氮端疏水域和抗原决定簇集中区域内部,包括组成VP28蛋白的第1到第114个氨基酸。