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我国是养猪大国,母猪繁殖力低下已成为制约我国养猪业生产发展的瓶颈之一。排卵数是决定母猪繁殖潜能的初始因素。研究发现排卵数较高的母猪表现出较少的卵泡闭锁,而雌二醇(E2)浓度低是猪卵泡闭锁的主要特征之一。E2对于维持猪生殖过程是必需的,适量的E2能够促进卵巢颗粒细胞增殖,同时抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。实验室前期研究发现E2合成通路关键限速酶P450arom编码基因CYP19A1在猪卵泡闭锁过程中表达下调,但其在猪卵泡闭锁中的作用和表达下调的机制尚不清楚。本文拟以猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1基因为研究对象,分析其在猪卵巢颗粒细胞凋亡和E2合成中的作用,以及转录因子SMAD4和miRNAs调控其表达的分子机制,以期为提高母猪繁殖力提供理论依据。全文的主要研究结果如下:(1)CYP19A1抑制猪卵巢顆粒细胞凋亡和促进E2合成利用RNA干扰技术(RNAi)和过表达技术敲低和过表达猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1,分析其对猪卵巢颗粒细胞凋亡和E2合成的影响。结果显示:CYP19A1特异性siRNA可有效敲低猪卵巢颗粒细胞内源性CYP19A1水平,卵巢颗粒细胞的凋亡水平显著上调,而卵巢颗粒细胞培养液中E2浓度显著下调;构建的猪CYP19A1基因真核表达载体可在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,过表达CYP19A1可显著抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡水平,上调颗粒细胞培养液中E2含量。上述研究结果证实CYP19A1是猪卵巢颗粒细胞中的抗凋亡因子,也是猪卵巢颗粒细胞中E2合成必需的。(2)SMAD4作为转录因子直接调控猪卵粟颗粒细胞中CYP19A1表达利用双荧光素酶基因报告系统鉴定出猪CYP19A1基因印卵巢特异性核心启动子区(-785/-681 nt),发现2个典型的SMAD4结合位点(SBE)。荧光素酶活性分析发现SMAD4可上调猪卵巢颗粒细胞CYP19A1基因启动子区活性,染色质免疫共沉淀(ChIP)试验证实SMAD4可与猪CYP19A1基因启动子区上SBE位点直接结合。流式细胞计数法(FACS)发现SMAD4可通过CYP19A1抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。放射免疫试验(RIA)显示SMAD4可通过CYP19A1促进猪卵巢颗粒细胞E2合成。上述研究结果充分表明SMAD4能够作为转录因子直接与猪CYP19A1基因启动子区结合,促进CYP19A1基因的转录,上调猪卵巢颗粒细胞中E2合成,从而抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。(3)SMAD4通过miR-126*/FSHR轴调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1表达利用生物信息学方法与分子生物学技术证实猪FSHR基因是猪卵巢颗粒细胞中miR-126’*的功能靶基因,miR-126*靶向抑制猪卵巢颗粒细胞中FSHR基因的表达,促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。序列分析发现猪miR-126*的启动子区上含有SBE位点,荧光素酶活性试验证实SMAD4作为转录因子可与miR-126*的启动子区上SBE位点结合,抑制猪卵巢颗粒细胞中内源性miR-126*的表达,上调猪卵巢颗粒细胞中FSHR基因的表达。随后设计共转试验通过QRT-PCR与western blot技术发现SMAD4通过miR-126**/FSHR轴促进卵巢颗粒细胞中CYP19A1的表达。以上结果证实在猪卵巢颗粒细胞中SMAD4作为转录因子通过靶向miR-126*/FSHR轴间接调控CYP19A1基因转录。(4)miRNAs在转录后水平调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1表达结合生物信息学分析与卵泡闭锁过程中差异表达miRNA芯片结果发现miR-10b与miR-146b-5p是猪CYP19A1基因潜在的调控miRNAs。在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中,利用荧光素酶活性试验、QRT-PCR与western blot等技术发现miR-10b与miR-146b-5p均可通过靶向结合CYP19A1基因3’-UTR并抑制其表达。FACS证实miR-10b与miR-146b-5p是猪卵巢颗粒细胞中的促凋亡因子,通过靶向抑制CYP19A1上调猪卵巢颗粒细胞的凋亡水平。放射免疫试验显示过表达miR-10b可通过CYP19A1显著抑制猪卵巢颗粒细胞中E2合成。上述结果充分说明miRNAs(miR-10b与miR-146b-5p)能在转录后水平调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1的表达与功能。综上所述,本文证实CYP19A1是维持猪卵巢颗粒细胞状态与E2分泌必需的。在猪卵巢颗粒细胞中,转录因子、表观遗传因子和调控轴(SMAD4、miR-10b、miR-146b-5p与miR-126*-FSHR轴)可通过直接与间接途径在转录水平与转录后水平调控CYP19A1的表达。研究结果为揭示CYP19A1基因在猪卵巢颗粒细胞中的功能与表达调控机制,解析猪卵泡发育与闭锁的调控网络提供理论依据。