戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是无包膜的单股正链RNA病毒,主要经消化道传播,引起急性病毒性肝炎(戊型肝炎,Hepatitis E,HE),严重危害人类健康。已在多种动物体内分离到HEV毒株,如家猪、野猪、鹿和猫鼬等,动物源性HEV可以交叉感染人类,引起人类急性HE。近年来在鸡体内分离出禽HEV,虽然尚无证据证明可以感染人类,但是禽类饲养从业人员存在较高的HEV抗体阳性率,令其研究也不容忽视。　　 HEV根据全基因组序列的差异分为4个主要的基因型,有学者建议将禽HEV归为基因5型。不同基因型毒株存在明显的流行病学特征差异,HEV基因1、2型仅感染人类,与HE流行和暴发相关,基因3、4型不仅可以感染人,也可以感染动物,常引起动物的亚临床型感染,禽HEV目前仅见感染禽类。提示HEV不同基因型毒株以及不同宿主来源的毒株可能具有不同的生物学特性,其抗原表位的差异及意义尚未得到深入研究。　　 由于HEV难以细胞培养,不能得到大量的病毒进行抗原结构的分析,因此只能用基因工程表达的HEV结构蛋白来代替。HEV的结构蛋白由其ORF2基因编码,聚合为病毒衣壳。多项研究表明,HEV ORF2基因编码蛋白C端2/3部分含有HEV优势抗原表位,包括能诱导免疫保护力的中和抗原表位。前期研究发现,HEV ORF2基因编码蛋白C端452～617aa的重组蛋白(p166)含有HEV构型依赖性中和抗原表位,诱导的抗体可以中和同型HEV的感染,在体外可以交叉中和不同基因型HEV对培养细胞的吸附反应。但当以不同基因型和亚型的p166抗原对HE病人和实验感染动物血清进行抗体ELISA滴定时,发现不同p166抗原敏感性不同,提示p166重组蛋白中可能存在与基因型相关的不同抗原表位。　　 为研究不同基因型和不同宿主来源的HEV抗原性异同,本文对HEV ORF2基因编码蛋白p166的抗原表位类型和特征进行了系统研究,旨在为HEV血清学分型、诊断试剂的开发、疫苗的研制以及对HEV的分类命名提供科学依据。　　 本研究分为5个部分:　　 一、抗HEV第1基因型ORF2 p166重组蛋白McAbs的制备和鉴定　　 以HEV第1基因型3个亚型代表毒株p166重组蛋白为免疫原,常规方法制备鼠源单克隆抗体(McAb)。结果如下:　　 A.以1a亚型pBur166(缅甸株)为免疫原,获得4株稳定杂交瘤细胞株,分别为:1B5、2B1、2C2、3G1。　　 B.以1b亚型pPak166(巴基斯坦株)为免疫原,获得2株稳定杂交瘤细胞株,分别为:3A3、5E9。　　 C.以1c亚型pMor166(摩洛哥株)为免疫原,获得4株稳定杂交瘤细胞株,分别为:6C7、4D7、1A6、6G1。　　 D.以Protein G亲和层析成功纯化McAbs,达到电泳纯,BCA定量,浓度在2.8～4.5 mg/ml。　　 二、HEV ORF2基因编码蛋白p166抗原表位特征的鉴定　　 为研究不同基因型和不同宿主来源的HEV的抗原表位特点,以所制备的McAbs为工具,用ELISA、Western-blot法,对不同基因型和亚型以及带有不同蛋白标签的p166重组蛋白进行McAbs识别抗原表位的类型鉴定,体外中和试验鉴定其中和活性。应用McAbs与p166区域的23个相互重叠的30～mer系列合成肽、6个100～aa重组蛋白、p166 N端和C端2～10 aa分别截短的22个重组蛋白进行抗原mapping,分析HEV ORF2基因编码蛋白p166的抗原表位特点。结果如下:　　 A.HEV第1基因型毒株ORF2编码蛋白上含有多种类型的抗原表位,既有不同基因型HEV共同性抗原表位,也有特异性抗原表位。这4种类型的抗原表位都是构象型抗原表位,其表位结构不能被相互重叠的30-mer合成肽和100～aa大小的HEV重组蛋白模拟。　　 B.2种HEV共同性抗原表位,2C2表位和3G1表位。3G1表位具有HEV中和活性,定位于HEV ORF2编码蛋白465～601 aa之间,其两侧460～465 aa、601～605 aa序列对表位构象的维持起重要的辅助作用。2C2表位定位于HEV ORF2编码蛋白452～601 an之间。　　 C.HEV第1、2基因型特异性抗原表位,281表位,提出HEV从血清学角度可以分为2个抗原型,HEV第1、2基因型和HEV第3、4基因型毒株分别属于抗原1型和抗原2型。　　 D.HEV1a、1c亚型特异性抗原表位,1B5表位。　　 三、单个氨基酸的改变引起HEV ORF2基因编码蛋白抗原表位的改变　　 制备单氨基酸位点突变的p166重组蛋白,研究1a、1c亚型特异性抗原表位特点。通过实验证实单个氨基酸的改变是引起HEV1b亚型巴基斯坦株ORF2编码蛋白抗原性变异的因为。结果如下:　　 A.采用引物诱导的突变策略,制备了pBur166和pPak166第155 aa和第163 aa单氨基酸交叉突变的4个重组蛋白,分别为pBur166/A155V,pPak166/V155A,pBur166/L163M和pPak166/M163L。　　 B.pBur166/A155V与McAbs1B5和6C7在ELISA和Western-blot中均不反应,而pPak166/V155A与1B5和6C7反应,说明155aa位点的A可能是构成HEV1B5表位的关键氨基酸,或者是辅助表位构成的关键氨基酸。　　 C.pPak166/M163L获得与1B5和6C7的弱Western-blot反应性,pBur166/L163M与IB5和6C7的反应性与pBur166一致,说明163aa不是1B5表位的关键氨基酸,对表位的构成可能只起辅助作用。　　 D.4种突变蛋白与2C2和3G1均反应,提示155aa和163aa改变对3G1表位和2C2表位结构无影响。　　 四、GST与HEV ORF2编码蛋白融合表达形成的新抗原表位的鉴定　　 采用McAb4D7与分别带有GST、His标签的p166重组蛋白、非融合蛋白pChn179、中国株p166的短片段重组蛋白pChn146-GST、pChn137-GST、GST融合的HEV无关蛋白以及GST蛋白,鉴定GST对融合表达蛋白抗原表位的影响,证实GST与融合表达的基因工程重组蛋白可以形成新的抗原表位,有可能影响重组蛋白的结构和抗原特征,造成研究结果的偏差。结果如下:　　 A.McAb4D7与HEV不同基因型和亚型的p166-GST蛋白反应良好,同时与GST反应阴性,证明McAb4D7是针对p166-GST重组蛋白的特异性McAb。　　 B.McAb4D7不能竞争抑制HRP-3G1与p166-GST重组蛋白的结合,说明4D7表位与3G1表位间不存在空间位阻,不是相同的抗原表位。　　 C.McAb4D7与带有His标签的HEV不同基因型重组蛋白p166-His,以及无蛋白标签的中国株ORF2重组蛋白pChn179不反应,提示HEV p166上不存在4D7识别的抗原表位,说明4D7表位不是HEV编码序列的特异性抗原表位。由于4D7也不与GST发生反应,因此推测它们识别的抗原表位可能是GST和p166氨基酸序列共同形成的新的抗原表位。　　 D.McAb4D7表现出了与HEV中国株p166的短片段重组蛋白pN460-C605(pChn146-GST)和pN465-C601(pChn137-GST)的良好反应性,提示4D7识别的表位是GST和HEV ORF2编码蛋白的465-601aa区段氨基酸序列共同形成的新的抗原表位,具有序列特异性,为空间构象型抗原表位。　　 E.McAb4D7与GST融合的无关蛋白不反应,再次证实4D7识别的表位是GST和p166氨基酸序列共同形成的新抗原表位,。　　 五、禽HEV有明显不同的抗原表位　　 采用人、猪、禽HEV ORF2基因编码蛋白p166human、p166swine和p268avian为包被抗原,检测人、猪、鸡来源的血清样本中抗HEV抗体,应用SAS软件进行相关性分析,结合序列分析,探讨人、猪、禽HEV间抗原表位的异同。从分子生物学和血清学角度研究人、猪、禽HEV之间的血清学关系。结果提示禽HEV具有明显不同于人、猪HEV的抗原表位,在所研究的区段无相似的抗原性,禽HEV是否是HEV,或者是构成了HEV的一个新的血清型值得作深入的研究,其分类和命名也应该有待于进一步的考证。结果如下:　　 A.序列分析显示,人、猪HEV序列有着高度的同源性,可以归入相同的基因型,而禽HEV与人、猪HEV在全基因组、ORF2核苷酸编码序列和氨基酸序列的同源性均比较低,不能归入同一基因型。禽HEV ORF2基因编码606个氨基酸序列,短于人、猪HEV ORF2基因编码蛋白约60 aa,其中含有多个缺失或插入突变,非一致序列占绝大多数,可能不具有相似的抗原性。　　 B.以p166human、p166swine和p268avian检测HE患者血清、正常人血清、猪血清和鸡血清抗-HEV IgG。p166human和p166swine对不同来源血清样本的抗体检出率非常接近,差异无统计学意义(p>0.05)；而p268avian与p166human、p166swine的抗体检出率差异显著,具有统计学意义(p<0.001)。提示p268avian与p166human、p166swine有着显著的抗原性差异。　　 C.p166human、p166swine两种抗原对7种不同基因型和亚型的p166免疫血清、p388Mex免疫血清、HEV McAbs、HEV Sar-55株感染恢复期猕猴血清、Mex株感染恢复期猩猩血清均呈阳性反应,而p268avian均呈阴性反应。提示p268avian与p166human、p166swine有着显著的抗原性差异。　　 D.将以p166human、p166swine和p268avian三种抗原检测过的上述抗体阳性血清样本包括HE患者血清133份、正常人血清7份、猪血清22份和鸡血清32份的ELISA结果进行抗原相关性分析,可见p166human与p166swine两种抗原对不同样本的检测结果均呈直线正相关关系,说明p166human和p166swine对不同血清标本的免疫反应性相近,抗原性密切相关。而p268avian与p166human以及p268avian与p166swine对不同样本的检测结果无直线相关性,提示p268avian与p166human和p166swine不具备相似的抗原性。　　 总之,HEV是一个新现病原体,对其研究尚不深入,很多的生物学特性尚不明了。本研究就其抗原表位的特征开展了一些基础研究,揭示了上述新的现象和内在关系,相信这些新的发现必将丰富HEV的研究成果,会对HEV的生物学特性、遗传变异、血清学分型、诊断试剂的开发、疫苗的研制以及对HEV本身的的分类命名提供有益的帮助。