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柑桔是芸香科植物,为世界第一大水果,也是我国最重要的果树之一。种子影响柑桔的生产和消费,无核或少核品种因食用方便和品质优良而备受消费者的青睐。但相对种子较多的品种,部分无核品种的丰产稳产性比较差,栽培管理难度高。目前关于柑桔种子发育进程中数量的变化以及与激素变化的关系尚无明确的研究结论。 本论文历时2年,对14份种子数量迥异的不同柑桔材料,显微观察了种子由胚珠到成熟种子的发育全过程,并在次年种子形态发育明显变化的前后时间段,采用高效液相色谱法测试了种子及其它果实组分的激素含量。 主要研究结果如下: 1.柑桔单果胚珠起始数目均远远高于果实最终的成熟种子数目,表明胚珠发育过程存在激烈的淘汰现象。 柑桔果实胚珠起始数目因品种类型差异而有所不同,并且远远高于成熟种子数目。甜橙的起始胚珠数在45~60粒,最终的成熟种子数品种间则在0~20粒之间均有;2个柚子的的起始胚珠数分别为140和160粒,最终的成熟种子数分别为80和120粒;兴津温州蜜柑的起始胚珠数为21粒,W-默科特的起始胚珠数为30粒左右,最终的成熟种子前者为0粒,授粉W-默科特约20粒,未授粉W-默科特约10粒;2个桔橙杂种TW6-1和TW6-2的起始胚珠数分别为33粒和21粒,最终的成熟种子分别为10粒和6粒。 2.35DAF(Day after flowering)左右是柑桔胚珠发育变化最为显著的时期。 对4个甜橙品种(埃及甜橙一号、塔罗科血橙、晚熟汤姆逊脐橙和长叶橙)连续两年的胚珠形态显微观察发现,在25DAF之前,单个果实所观察的胚珠几乎无差别,全部饱满圆润、大小难辨。而在35DAF,胚珠形态出现了明显分化,可区分为明显发育胚珠(Obviously developed ovules,ODOs)和滞后发育胚珠(Develop-lagged ovules,DLOs)。ODOs最终发育成正常的种子和败育的种子(统称成熟种子),DLOs则最终在果实发育成熟后形成痕迹状的残留物保留在果实囊瓣中轴内侧。 其他10个品种,观察时间主要在第二年。结果发现果实发育过程中胚珠的变化类似上述四个甜橙品种变化。除W-默科特(授粉和未授粉)、TW6-1和TW6-2品种胚珠分化略早一些(在32DAF左右),其他品种在35DAF左右时,单果胚珠形态出现明显分化。所有试验品种无论成熟期早晚和种子数量差异,胚珠形态分化完成的时间基本一致。在观察时间点35DAF,最早提前3~5天,柑桔果实胚珠形态分化已经完成,种子数量已经确定。 3.胚珠形态发育变化最为显著的时期与柑桔的受精卵开始启动发育的时段和柑桔的第二次生理落果期重合。 资料以及我们的田间观察表明,25DAF和35DAF这段时间,不仅是柑桔种子数量差异形成的关键时期,也是柑桔受精卵开始启动发育的时段,同时又与柑桔的第二次生理落果期吻合,因此,本段时间柑桔胚珠的生长发育应与受精卵的启动和二次生理落果关系密切。 4.对玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)四种植物内源激素进行了提取和高效液相色谱(HPLC)检测,建立了最佳检测条件,完成了4个时间点所有品种整果、果皮、果肉和胚珠的激素提取和检测。 (1)流动相:乙腈:甲醇:磷酸缓冲液(pH3.0)=20:20:60,进样量:10ul,流速:1ml/min,柱温:35℃,检测时间:20min。 (2)对混合标准品连续6次进样,ZT、 GA3、 IAA和 ABA四种激素保留时间分别为:2.9722±0.0071min、3.4042±0.0013min、7.2448±0.0122min和10.1558±0.0133min。RSD为0.0009%~0.0059%,表明保留时间重复性良好。 (3)加标回收法测得ZT、GA3、IAA和ABA回收率分别为76.5%、71.7%、79.0%和75.1%,证明激素的提取方法可靠。 5.激素含量在胚珠发育变化最显著时期存在显著变化。 对25DAF、35DAF、50DAF和65DAF四个时间点,所有品种整果、果皮、果肉和胚珠的激素含量进行分析,发现所有品种四个时期各个部位基本上均是GA3含量最高,含量最少的为ABA。 在25DAF和35DAF,不同品种ABA含量的变化与品种的种子数量的相关性最明显。在35DAF时,种子较多的品种如埃及甜橙一号的ABA含量,与25DAF相比骤然下降;而无核或少核品种如纽荷尔脐橙、塔罗科血橙、福本脐橙等品种的ABA含量则表现上升。在W-默科特(授粉和未授粉)、TW6-1与TW6-2四个材料中,种子偏多的W-默科特(授粉)和TW6-1品种的ABA在35DAF是下降的,种子相对偏少的W-默科特(未授粉)和TW6-2则相反。 6.整果中四种激素比例在胚珠发育变化最明显时期存在显著差异。 资料表明内源激素比值R((ZT+GA3+IAA)/ABA)的下降是导致胚胎败育的关键因素。对14个品种整果的R值在四个时期作了比较分析,发现该值在35DAF前后发生剧烈变化。在35DAF时,无核品种或种子相对较少品种的R值均明显降低,而种子较多的品种则明显上升。 变化的幅度因品种类型不同而存在一定的差异,如种子数高达120粒的沙田柚R值增长幅度约是埃及甜橙一号的20倍,是w-默科特(授粉)的10倍左右。无核或少核的纽荷尔脐橙、塔罗科血橙的下降幅度是种子相对稍多的长叶橙和晚锦橙1.35~5倍。在默科特品种中,人工授粉后整果R值上升,而未授粉则下降。桔橙杂种TW6-1和TW6-2的R值均呈现上升趋势,但种子偏多的TW6-1的R值增长幅度略高于种子相对较少的TW6-2。 7.激素含量及比例在W-默科特授粉与未授粉果实的胚珠发育变化最显著时期存在明显差异。 对各时段W-默科特授粉与未授粉的整果、果皮、果肉和胚珠四种植物激素含量,分别进行比较分析。发现在25DAF时,从整果看,ZT、GA3、IAA和ABA的含量,W-默科特授粉分别是未授粉的1.20、0.97、0.98和8.70倍,前三种激素非常一致,但ABA明显高出多倍;从胚珠看,四种激素的含量,W-默科特授粉分别是未授粉的0.50、0.59、0.46和0.99倍,前三种激素前者是后者的近半,而ABA基本一致。在35DAF,从整果看,ZT、GA3、IAA和ABA的含量,W-默科特(授粉)分别是W-默科特(未授粉)的0.56、0.51、0.58和0.87倍,前三种激素前者是后者的近半,ABA基本一致;从胚珠看,四种激素的含量,W-默科特授粉分别是未授粉的1.65、3.51、6.90和14.39倍,前三种激素前者是后者的2倍或更高,ABA提升10倍以上。 与25DAF相比,在35DAF时W-默科特授粉与未授粉整果的ABA含量的比值降低了9倍,其他三种激素的相应比值也有了较大的下降趋势;在果皮中,各激素比值前后也发生了剧烈的变化。在种子形成关键时期前后,胚珠中IAA和ABA在W-默科特授粉和未授粉比值变化幅度较果皮偏高了13倍以上。