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[目的]:研究人脂肪干细胞(humanAdipose-derivedStemCells,ADSCs)在体外单层培养条件下诱导为软骨细胞可行性;研究脂肪干细胞与脱钙骨复合物在三维诱导培养条件下,回植到裸鼠皮下环境中组织形成情况,为软骨组织工程临床应用提供初步实验和理论依据。
[材料与方法]:对脂肪抽吸物中分离的间质细胞进行体外培养诱导。实验在两种条件下进行,单层诱导培养和三维诱导培养(支架为脱钙骨),每种实验条件各设诱导组和未诱导组,诱导组用含有TGF-β1、地塞米松等特定诱导培养液进行诱导培养,对照组的培养液为含10﹪FBS的DMEM。每天光镜下观察单层诱导和未诱导的脂肪干细胞形态学的改变,培养三天后免疫组化、原位杂交和RT-PCR等方法检测胶原和蛋白多糖的体外表达情况;脂肪干细胞-脱钙骨复合物诱导实验组和未诱导对照组体外培养6天,回植到裸鼠皮下,分别于2、4、6、8、10周取材。石蜡切片免疫组化、Massons、Alicians染色进行胶原和蛋白多糖表达、分布鉴定。
[结果]:未诱导的脂肪干细胞呈克隆性生长,细胞形态呈长梭形;诱导后细胞逐渐呈三角形、多角形等软骨细胞样形态。免疫组化、原位杂交显示诱导后ADSCs表达Ⅱ型胶原,但同时也观察到Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR证实诱导ADSCs表达aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA,同时表达Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ、Ⅺ型胶原mRNA,未见Ⅸ型胶原mRNA表达;未诱导ADSCs不表达aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA。三维诱导后回植皮下2、4、6、8、10周取材、切片,实验组免疫组化显示表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原;Massons、Alicians染色可见材料内的胶原分泌旺盛,有酸-1-性粘多糖沉积,但组织学观察特征性的软骨组织结构形成不明显;对照组未见Ⅱ型胶原及酸性粘≥糖沉积。
[结论]:脂肪干细胞单层诱导培养条件下,能分泌软骨细胞特征性细胞外基质-Ⅱ型胶原、aggrecan等,脂肪干细胞可作为软骨组织工程种子细胞的重要来源;诱导后回植的细胞-脱钙骨复合物可表达特异的软骨基质-Ⅱ型胶原和蛋白多糖,但软骨组织特征性结构形成不明显。