薄荷幼叶蔗糖酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究和固定化初探

来源 :西南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:datou19881020
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蔗糖酶(EC3.1.2.26)是一种水解酶,又名转化酶。不可逆催化蔗糖水解,生成葡萄糖和果糖。广泛存在于动物、植物、微生物中。在植物生长发育和代谢过程中,蔗糖酶分解蔗糖成己糖可为植物的成长、发育提供能源和碳源,是植物碳氮代谢中的关键酶。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用,并在渗透调节、抗逆性、生长繁殖、以及信号传导等方面发挥着重要的作用。薄荷(Mentha haplocalyx Briq)植物属于唇形科(Labiatae Linn)薄荷亚族(Menthinae Briq),为芳香多年或一年生草本,是收获叶片的作物,我国占12种,是北半球重要的经济作物之一。近年来越来越多的关于薄荷植物化学、药理学方面的研究,薄荷已广泛用于食品加工业和药学领域。本研究一方面可以弥补我国在薄荷相关研究的空白,提供一定的理论基础;另一方面,可以让更多人认识到薄荷的价值,让薄荷的的利用价值得到更大程度的开发,提高其经济价值。本论文主要对薄荷叶片蔗糖酶的分离纯化、理化性质、酶促动力学性质、抑制剂以及功能基团的化学修饰和固定化等方面进行了研究,结果如下:1.蔗糖酶的分离纯化以薄荷叶片为原材料通过组织捣碎、缓冲液抽提、超滤、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等方法获得蔗糖酶,以SDS-PAGE和等点聚焦电泳检测其纯度,获得了电泳纯的薄荷叶片蔗糖酶,纯化倍数为186.3倍,比活性为67.06U/mg,回收率为24.9%。2.蔗糖酶的性质研究理化性质研究表明,蔗糖酶全分子量为130.0KD,亚基分子量为64.5KD,表明蔗糖酶是由两个相同的亚基组成,其等电点为5.6。酶促动力学研究表明,蔗糖酶的最适pH值为5.0,在pH4.5-5.5的范围内比较稳定,最适温度为55℃,温度高于65℃以上不稳定,米氏常数Km值为12.25mmol/L。3.金属离子及相关试剂的影响金属离子中对蔗糖酶的抑制能力较强的是As5+、Ag+、Pb2+;而Cr3+、Mg2+、K+、Ba2+、Fe2+对其活性仅有较弱的抑制作用;Cu2+、Mn2+对薄荷的蔗糖酶有激活作用。在实验的几种化学试剂中,EDTA的抑制作用最强,其次是双氧水,尿素和抗坏血酸。4.蔗糖酶的化学修饰采用NBS、PMSF、IAc、BrAc、SUAN、TNBS、PCMB、DTT修饰剂在一定的条件下修饰蔗糖酶,表明:PMSF、NBS、PCMB显著地抑制酶的活力,而BrAc、IAc、TNBS、SUAN、DTT对酶的活力影响不大。5.蔗糖酶的固定化以PVA-CA为载体,戊二醛为交联剂,采用包埋法制备固定化蔗糖酶。最佳条件为:3%海藻酸钠,1:2.5的载体与酶液(Ⅴ/Ⅴ)比例,0.5%戊二醛交联0.5h,酶活力回收率达到45.7%。固定化酶的最适温度为55℃,与游离酶相同,最适pH值为5.0,也与游离酶相同,且有更宽的适宜反应的范围。将固定化酶储存于4℃冰箱中一个月活性几乎无损失,有良好的储存稳定性。
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