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急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种涉及多系统的常见临床危重病症,可由多种原因引起,常表现为急性肾脏功能下降、伴或不伴少尿或无尿,有较高的病死率,并且在慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)和终末期肾病(End stage of renal disease,ESRD)的发生发展中起重要作用,对患者的生命安全以及生存质量造成了严重威胁。因此,深入研究急性肾损伤的发生发展机制对早期预防AKI发生及控制CKD进展具有重要意义,但目前关于急性肾损伤的确切细胞内信号通路尚不清楚。近年来,线粒体功能障碍在肾脏疾病中的作用受到越来越多的关注。线粒体是生物体能量供应的工厂,是多种生物学功能发生的主要场所。肾脏对其正常功能的维持需要消耗大量的能量,线粒体的任何功能环节出现问题,都将导致肾脏功能的异常。有文献报道,线粒体功能障碍涉及相当广泛的疾病,并对肾脏疾病的发生发展起着重要作用。有研究表明,在急性肾损伤模型中存在线粒体的异常,包括形态异常、mtDNA突变及拷贝数下降等,最终可诱导细胞的凋亡。本课题组前期研究发现线粒体功能障碍是包括急性肾损伤在内的多种肾脏病模型的早期事件,参与疾病的发生发展,阻断线粒体功能障碍可对肾脏发挥保护作用。因此,寻找保护线粒体功能的方法成为了解决肾脏疾病的关键。随着人们对生命科学的深入研究与发展,非编码RNA的生物学功能也被越来越多地发掘,microRNA作为其中一类,因其作用广泛而渐受重视,在各领域均有研究。microRNA是一类长约22bp的非编码RNA,通过与靶基因3’-UTR区不完全或完全结合而抑制靶mRNA的翻译或促进其降解,进而参与调控机体细胞增殖与分化、凋亡和氧化应激等生理病理过程。本研究组前期对醛固酮灌注小鼠肾损伤模型进行microRNA芯片分析,发现模型组肾皮质中miR-709较假手术组明显增高。在顺铂诱导的体外肾小管上皮细胞损伤模型中,我们发现顺铂可呈剂量与时间依赖性地诱导miR-709表达,而下调miR-709可通过其靶基因TFAM减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤。但miR-709在急性肾损伤体内模型中的作用尚不清楚,因此深入探讨miR-709在急性肾损伤体内模型中的功能与机制,可能为防治急性肾损伤和肾脏疾病的进展带来新的思路与手段。目的:观察miR-709在顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型中的表达,并明确下调miR-709在顺铂诱导小鼠急性肾损伤中的作用及其对线粒体功能的影响。方法:使用顺铂建立实验性肾脏病动物模型,观察miR-709在顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型中的表达水平及分布情况。通过腹腔注射miR-709 antigomir(20mg/kg)和顺铂(20mg/kg)构建miR-709干预AKI动物模型,明确下调miR-709在顺铂诱导小鼠急性肾损伤中的作用及对线粒体功能的影响,该模型将SPF级健康C57BL/6J成年雄性小鼠分为以下四组:对照组(Anti-control)、miR-709 对照组(Anti-miR-709)、模型组(Anti-control+cisplatin)、miR-709 干预组(Anti-miR-709+cisplatin)。于造模完成后72小时处死小鼠,心脏取血,10,O0Og离心10分钟分离血浆,检测血肌酐水平;应用PAS染色后于光镜下观察肾组织病理形态改变,并使用改进后的Broekema盲法对各组小鼠肾脏病理损伤程度进行评分;应用qRT-PCR(quantitive real time PCR,实时定量PCR)检测miR-709、TFAM(mitochondrial transcription factorA,线粒体转录因子)、mtDNA(mitochondrial DNA,线粒体 DNA 拷贝数)、NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,中性粒细胞明胶酶运载蛋白)和 Kim-1(kidney injury moleculer 1,肾损伤分子)的核酸表达水平;应用Western Bolt检测TFAM、NGAL和Kim-1的蛋白表达水平;应用原位杂交免疫荧光法检测肾组织中miR-709的表达与分布;应用TUNEL染色法检测肾皮质中肾小管上皮细胞的凋亡情况;应用纯化线粒体氧化应激活性氧初级荧光试剂盒(GENMED)检测mitoSOX(mitochondrial superoxide,线粒体超氧化物)的水平;应用冰冻切片线粒体内膜功能荧光测定试剂盒(GENMED)和JC-1染色结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位。结果:(1)顺铂处理后,可在光镜下观察到小鼠肾组织中小管上皮细胞水肿、管型形成和刷状缘脱落,其病理损伤程度评分较对照组明显增高,约上升23.5倍(P<0.001);TUNEL染色结果显示,20mg/kg的顺铂可明显诱导肾小管上皮细胞凋亡,凋亡细胞约增至3.5倍(P<0.001);此外,血肌酐检测发现模型组血肌酐水平较对照组上升了约7.3倍(P<0.05);核酸和蛋白水平检测发现腹腔注射顺铂72小时后,NGAL和Kim-1的表达显著增加,其核酸水平分别增高了1632.4倍(P<0.001)和2.4倍(P<0.05)。(2)顺铂诱导小鼠肾脏中miR-709的表达:与对照组相比,腹腔注射顺铂(20mg/kg)72小时后可显著诱导小鼠肾皮质中miR-709的表达,约升高1.7倍(P<0.05),并且其主要表达于肾小管上皮细胞胞核中,少量表达于胞浆中。(3)小鼠腹腔注射miR-709 antigomir可显著下调肾脏中miR-709的表达,核酸水平下调幅度达99%以上(P<0.05);下调小鼠体内miR-709可阻断顺铂诱导的小鼠肾功能降低和肾小管上皮细胞损伤,与miR-709对照组相比,miR-709 antigomir预处理明显减轻了顺铂诱导的肾小管损伤,miR-709干预组的小鼠肾小管上皮细胞变性、坏死、管型形成以及刷状缘脱落等损伤均明显好转,其病理损伤程度评分也显著降低,约下降了 53%(P<0.05),肾皮质中肾小管上皮细胞的凋亡也明显减少,约下降了 47%(P<0.05),而血肌酐水平较模型组降低了约67%(P<0.05);此外,顺铂诱导NGAL和Kim-1的表达增加也被明显抑制,与miR-709对照组相比,miR-709干预组小鼠肾组织中NGAL和Kim-1的核酸水平分别降低了约99%和51%(P<0.05)。(4)顺铂可降低小鼠肾脏皮质中TFAM的表达(下降60%,P<0.05)并诱导线粒体功能障碍的发生,使线粒体膜电位水平(JC-1)降低(下降71%,P<0.05)、线粒体活性氧产生增多(升高2.4倍,P<0.05)以及线粒体DNA拷贝数下降(下降63%,P<0.05)。下调miR-709后小鼠肾脏中TFAM的表达上调(增高2.1倍,P<0.05)且减轻了线粒体功能障碍,使线粒体膜电位水平上升(增高2.1倍,P<0.05)、线粒体活性氧产生减少(下降60%,P<0.05)以及线粒体DNA拷贝数增多(增高 2.8 倍,P<0.05)。结论:顺铂可上调肾组织中miR-709的表达;下调miR-709可以显著减轻顺铂诱导的肾脏线粒体功能障碍及急性肾损伤,提示miR-709参与了 AKI的发生和发展。