骨肉瘤(Osteosarcoma)一般指传统骨肉瘤,是原发髓内高度恶性肿瘤,也称为成骨肉瘤,是发生在骨组织的最常见的原发性恶性肿瘤,在原发骨肿瘤中骨肉瘤的发病率居与第二位,仅次于浆细胞骨髓瘤。骨肉瘤有两个发病高峰,最常发生在10-20阶段,其次是40岁以上,男性好发,男女性发病率比值约为3:2。骨肉瘤起源于原始骨形成间质细胞,常发病于四肢长骨,尤其是股骨远端、胫骨近端结合肱骨近端,其中干骺端约占91%,骨干约占9%。骨肉瘤的分类比较复杂,常需要其他方法的借助来进行肿瘤分类,例如,采用组织化学方法判断肿瘤内碱性磷酸酶的含量,组织免疫学等方法。骨肉瘤恶性程度高,易发生耐药和早期远处转移等,其中以肺转移最为常见,病死率和致残率均较高,所以攻克骨肉瘤已成为骨科的当务之急。在肿瘤的治疗中,诱导肿瘤细胞发生凋亡是治疗的一个重要目标,近年来,许多学者把目光放在寻找新的药物或开发新药上,以寻求更好的治疗效果,而祖国传统中药则是一个无尽的宝库,值得深入开发和挖掘。华蟾素是中华大蟾蜍全皮经过一系列水化萃取步骤而制成的中药制剂,其功效主要包括:解毒、解热、消除肿痛、抗肿瘤、免疫促进、抗病毒等多种作用,华蟾素化学成分较为复杂,包括吲哚生物碱、还原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等等,华蟾素作为一种祖国传统药物,其具有低毒、抗癌谱广等诸多优点,目前已成为我国临床上应用较广的抗肿瘤中药制剂之一。华蟾酥毒基(cinobufagin,CB)是华蟾素中提取的主要毒性配基之一,亦具有良好的抗肿瘤作用。先前有许多研究证实华蟾酥毒基可以通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导其凋亡来发挥抗肿瘤作用。具体而言华蟾酥毒基对肝细胞癌、小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等多种实体恶性肿瘤具有良好的抗癌功效。但将华蟾酥毒基应用于骨肉瘤的研究还并不多见。本实验探讨了华蟾酥毒基在体外和体内对三种人源骨肉瘤细胞系MG63、U20S、143B细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用,并检测了其对凋亡相关mRNA和蛋白表达的影响。机制上,对Notch在华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用进行了较为深入的研究,猜想华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡是通过失活Notch信号通路而实现的。最后通过慢病毒转染的方式,人为构建Notch激活和关闭系统,对猜想的可能机制进行了验证。文章从细胞层面到动物层面均进行了较为深入的研究,提供了较具有说服力的结果和结论,为明确华蟾酥毒基的抗肿瘤机制提供坚实的实验基础和理论依据。第一部分 华蟾酥毒基抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡的实验及机制研究目的:探讨华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞系MG63、U20S和143B增殖抑制和诱导凋亡的作用和可能机制。方法:将不同浓度华蟾酥毒基(0、20、50、100、150、200、250 nmol/L)作用于骨肉瘤MG63、U20S和143B细胞,CCK-8法被用来检测不同浓度组骨肉瘤细胞的存活率,Hoechst 33258染核染色法被用来从形态学上观察细胞凋亡,Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪来检测骨肉瘤MG63、U20S和143B细胞的凋亡率,RT-PCR以及Western Blot实验被用来检测细胞内与凋亡相关的指标以及Notch信号通路相关mRNA和蛋白的表达。结果:严格按照上述方法处理骨肉瘤MG63、U20S和143B细胞后,CCK-8结果显示,随着华蟾酥毒基浓度的增高和作用于时间的延长,细胞生长存活率明显降低,并呈浓度和时间依赖性关系。Hoechst 33258结果显示随着华蟾酥毒基浓度的增高,凋亡小体也逐渐增多。流式细胞仪结果显示随着华蟾酥毒基浓度的增高,凋亡率逐渐增加。通过RT-PCR和Western Blot检测结果显示,华蟾素处理细胞48 h后细胞中凋亡相关蛋白bax(促凋亡蛋白)的表达逐渐增加,而bcl-2(抗凋亡蛋白)逐渐减少,并且bax/bcl-2比值也明显增加(P<0.05)。Notch信号通路相关蛋白Notchl,Hes-1,Hes-5,Hey-1的表达量与华蟾酥毒基作用时间和作用浓度呈负相关。结论:华蟾酥毒基能诱导人类骨肉瘤细胞凋亡,其作用效果呈浓度与时间依赖性,与激活凋亡相关通路蛋白表达相关,而其机制可能与抑制Notch信号通路有关。第二部分 华蟾酥毒基抑制体内骨肉瘤的生长的实验及机制研究目的:通过观察华蟾酥毒基对裸鼠异体移植骨肉瘤模型的治疗作用,旨在探讨华蟾酥毒基对骨肉瘤增殖的抑制作用和诱导凋亡的能力及相关机制,为华蟾酥毒基的临床应用提供实验基础和理论依据。方法:本研究采用143B骨肉瘤细胞系,通过皮下接种成瘤的方式构建小鼠的骨肉瘤异体移植模型,检测华蟾酥毒基在体抑制骨肉瘤生长的作用。阴性对照组采用等量PBS处理,空白对照组不作任何处理(健康鼠)。华蟾酥毒基处理组采用4mg/kg的华蟾酥毒基进行腹腔注射,共1周,每天两次。实验过程均在SPF级动物实验中进行,接种后置于SPF级动物实验中心饲养。间隔一日观察裸鼠一般情况,包括活动量、进食情况、大小便、肤色,待肿瘤出现后,每5天用游标卡尺测量成瘤块的最小短径(Width)和最大长径(Length),肿瘤体积(mm3)估算公式为:(最小短径)2X(最大长径)/2。根据公式计算肿瘤体积,并记录体重情况。成瘤成功后,连续观察8周,断颈处死裸鼠,从皮下完整剥离取出瘤体组织,用游标卡尺测量瘤体的大小。瘤体组织切片后,分为三大部分,一部分用于RT-PCR实验,一部分用于Western Blot实验,另一部分置4%多聚甲醛中固定24小时,用于制作石蜡组织切片。切片用于后续HE染色及免疫组织化学染色(IHC)等。结果:1.体内实验结果显示,用4mg/kg的华蟾酥毒基治疗实验组骨肉瘤模型鼠7天(每天两次),与对照组(等量PBS处理)相比,实验组小鼠的瘤体体积较对照组相比明显变小。2.实验组小鼠的体重与无肿瘤负荷的健康鼠相比,无明显差异。3.实验组瘤体凋亡相关指标bax的mRNA(促凋亡基因)表达较对照组增加,而bcl-2的mRNA(抗凋亡基因)表达较对照组逐渐减少,并且bax/bcl-2比值也明显增加(P<0.05)。4.实验组Notch信号通路相关mRNA,NICD1,Hes-1,Hes-5,Hey-1的表达量较对照组明显降低(P<0.05)。5.检测终点显示实验组小鼠存活率较对照组高。结论:体内研究表明,华蟾酥毒基能抑制人骨肉瘤模型鼠的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,提高荷瘤小鼠的生存率,其机制可能与瘤体内Notch通路失活有关。第三部分 干扰Notch信号通路对华蟾酥毒基作用于骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响目的:探究改变Notch信号通路的表达水平会对华蟾酥毒基移植骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡造成何种影响,明确Notch信号通路在其中的作用及调节机制。方法:构建Notch信号报道载体慢病毒,筛选稳定转染的骨肉瘤细胞系,通过RT-PCR和Western Blot验证其诱导表达的效果。CCK-8法检测华蟾酥毒基作用于不同Notch表达水平的骨肉瘤后,其细胞存活率。流式细胞仪检测华蟾酥毒基作用于不同Notch表达水平的骨肉瘤后,其细胞凋亡率。结果:1.稳定转染的骨肉瘤细胞系能够达到预期的效果,获得Notch激活和Notch关闭的亚型。2.Notch激活的细胞系其细胞存活率最高,Notch关闭的细胞系其存活率最低,未做转染的Notch表达成常态的细胞系其存活率居中。3.Notch激活的细胞系其凋亡率最低,Notch关闭的细胞系其凋亡率最高,未做转染的Notch表达成常态的细胞系其凋亡率居中。结论:Notch信号通路激活能够抵抗华蟾酥毒基的毒性作用,抵抗华蟾酥毒基诱导的凋亡,显示出更加耐药的特性。Notch关闭促进华蟾酥毒基的毒性作用,促进华蟾酥毒基诱导的凋亡,显示出增敏效应。