论文部分内容阅读
MicroRNA（miRNA）在植物的生长发育和应答环境胁迫中具有十分重要的作用。尽管miRNA在模式植物如拟南芥及水稻中的功能已经得到相对透彻的研究，但是在野生稻中的相关研究报道比较少。本研究论文拟应用小分子RNA高通量测序技术平台，系统分析长雄野生稻地上茎及地下茎组织特异以及冷胁迫差异表达miRNA，试图从miRNA角度解析调控地下茎生长发育以及长野应答低温胁迫的分子机理。具体研究结果如下：1）构建了长雄野生稻的地上茎、地下茎正常生长及低温胁迫处理的4个小RNA文库，并进行Illumina深度测序。对四个样品的测序丰度进行分析发现长度大部分分布在21-24个核苷酸之间。通过生物信息学分析，共鉴定了646个miRNAs，其中290个miRNAs在地上茎和地下茎差异表达；对地下茎中特异或差异表达的miRNAs进行靶基因预测，发现了对应230个靶基因，其中大部分为转录因子，包括MADS、SBP、ARF、MYB及GRF等，这些基因在长野地下茎的生长发育分子调控中起十分重要的作用。2）在低温胁迫处理下，两组织中总共检测到269个miRNAs差异表达，其中大部分为下调表达，而且地下茎下调的趋势不如地上茎中明显，表明两组织有不同的低温胁迫应答机制。采用RNA加尾和引物延伸RT-PCR的策略对获得的部分差异表达miRNAs进行实验验证，结果表明测序结果与RT-PCR结果高度一致。3）采用RLM-RACE对miRNAs靶基因的裂解位点进行分析，验证了6个miRNAs的8个靶基因，并且验证的切割位点不仅出现在miRNA结合位点，还出现在结合位点的上下游，显示这种特有的剪切方式存在于复杂遗传背景植物诸如长野中。对应靶基因表达分析发现，大部分miRNAs与对应靶基因的表达呈相反表达趋势，但是部分miRNAs与相应靶基因表达趋势相同。这些结果表明miRNA对靶基因的调控相当复杂，可能一个miRNA可以调控多个靶基因，一个靶基因有可能受多个miRNAs调控，同时还有可能是miRNA自身负反馈调节机制的影响，或者是miRNA是通过翻译抑制的方式作用于靶基因。