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非病毒载体因为安全性好、操作简便、免疫原性低等方面而优于病毒载体。但是较低的转染效率和治疗基因的短暂表达严重限制了其临床应用。我室构建的人核糖体区打靶载体pHrneo,可以高效定点整合到rDNA区(定点整合率10-5-10-4)而使外源基因得到长期的表达。人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblast,HDF）因为易于操作和培养而成为ex vivo基因治疗策略中的理想靶细胞,但是较低的转染效率,限制了其在临床基因治疗研究中的应用。当质粒较大时（一般超过10kb,MW＞700KD）,其在细胞质中被阻滞的时间就会越长,转染率也会迅速下降。携带治疗基因的重组pHrneo质粒一般为10-16kb,细胞质及核膜的阻滞作用是其转染效率低下的重要原因。目的:为提高人核糖体区打靶载体的转染效率,我们采用了两种策略促进质粒DNA（pDNA）进入细胞核,以降低细胞质及核膜阻滞对转染效率的影响:1)核定位信号（nuclear location signal,NLS）促进质粒DNA快速进入细胞核,使其在被细胞质中核酸酶降解之前得以表达,从而达到提高转染效率的目的;2)两亲性小分子可以干扰核孔复合体的疏水结构,从而打破核膜障碍,促进质粒DNA进入细胞核,提高转染效率。方法:1):利用NLS与重组pHrneo质粒通过静电作用结合,0.6%琼脂糖凝胶阻滞实验检测偶联效果;DNaseⅠ模拟细胞质内的核酸酶酶切,评价NLS对pDNA的保护作用;不同偶联比例的NLS/pHrnGFP复合物利用聚乙烯亚胺（PEI）法转染人皮肤成纤维细胞,48小时后流式细胞仪检测GFP表达效率;转染Cy3标记pHrnGFP后1小时,激光共聚焦显微镜检测质粒的亚细胞位置。2)DMSO预处理HDF后Lipofectamine2000转染pHrnGFP,24小时后流式细胞仪检测GFP表达效率;流式细胞仪分析DMSO处理对HDF的细胞周期的影响;转染Cy3标记pHrnGFP后30分钟,激光共聚焦显微镜检测质粒的亚细胞位置。MTT实验评价NLS及DMSO对HDF的细胞毒性。结果:1)琼脂糖凝胶实验显示NLS与pDNA偶联后可以降低其在凝胶中的迁移速度;当NLS/pHrnGFP偶联比例大于2×104时,可以在一定程度上防止DNaseⅠ的降解,并显著提高人核糖体区打靶载体pHrnGFP的转染效率4-5倍。激光共聚焦显微镜观察NLS可以促进pHrnGFP在1小时内进入细胞核。2)应用2%DMSO预处理HDF48小时后,再采用Lipofectamine2000法进行转染,可以显著提高pHrnGFP的转染效率2-3倍;DMSO处理后90%的HDF阻滞在G1期,除去DMSO后HDF继续增殖;激光共聚焦显微镜下观察,pHrnGFP可以在30分钟内进入DMSO处理细胞的细胞核。结论:NLS可以促进人核糖体区打靶载体快速进入细胞核,并显著提高核糖体区打靶载体转染HDF的效率。应用2%DMSO预处理HDF48小时,可以有效干扰核孔复合体的疏水结构,显著提高核糖体区打靶载体的转染效率。两种方法为核糖体区打靶载体应用于临床基因治疗研究奠定了一定的基础。