大豆贮藏蛋白是重要的食用植物蛋白,也是大豆的主要组成部分,其营养价值丰富、全面,食用和加工特性优良,拥有广阔的应用前景。近年来,本实验室获得一系列稳定的特异性亚基缺失材料,其中发现自然缺失A_1aB_1b的缺失材料桂阳紫金豆。本研究以亚基对照品种南农大黄豆和A_1aB_1b缺失体桂阳紫金豆为材料,在前人研究基础上,开展以下几方面的研究:①大豆A_1aB_1b亚基基因Gy1的分离与序列分析;②大豆Gy1基因编码蛋白A_1aB_1b亚细胞定位及缺失的分子机制研究;③大豆Gy1基因蛋白的原核表达和纯化;④Gy1基因重组蛋白生物学特性研究。主要研究结果如下:1、从开花后30天的南农大黄豆和桂阳紫金豆籽粒中提取RNA,分离和鉴定到两个品种Gy1基因,通过生物信息学、数据库全面分析Gy1基因和其编码蛋白的结构特征:南农大黄豆Gy1基因ORF全长1488 bp,DNA序列全长2753 bp,桂阳紫金豆Gy1基因ORF全长1161 bp,DNA序列全长3607 bp;自然缺失A_1aB_1b亚基材料桂阳紫金豆Gy1基因比对照品种南农大黄豆DNA序列多两段584 bp首尾相连的重复序列,cDNA中也有两段首位相连的203 bp的重复序列,因此桂阳紫金豆Gy1基因读码框将发生改变,终止密码子提前,编码氨基酸序列比南农大黄豆A_1aB_1b少了 104个氨基酸残基,即桂阳紫金豆A_1aB_1b只有酸性肽链和部分碱性肽链,这是亚基缺失的根本原因;A_1aB_1b蛋白表现为亲水的不稳定酸性蛋白且不存在跨膜结构,完整的A_1aB_1b中,含硫氨基酸占2.2%,甲硫氨酸占1.4%;缺失体A_1aB_1b中含硫氨基酸占2.6%,甲硫氨酸占1.6%。A_1aB_1b蛋白均不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸;蛋白质二级结构预测分析A_1aB_1b全蛋白α-螺旋占31.6%、β-转角占8.29%、延伸链占14.51%、随机卷曲占44.60%,缺失体蛋白α-螺旋占29.7%、β-转角占7.07%、延伸链占19.19%、随机卷曲占44.04%;全蛋白由两个完整的特异性"Cupin₁"结构域、两个非特异性的"Cupin₁"结构域、一个"PLN00212"保守域和两个"ABD超家族";缺失体蛋白只有一个完整的特异性"Cupin₁"结构域、一个完整的非特异性的"Cupin₁"结构域、"PLN00212"保守域和一个不完整的"ABD超家族"。三维结构预测发现A_1aB_1b全蛋白是一个非对称的三聚体,但A_1aB_1b缺失体蛋白只有一个单体组成。2、原生质体亚细胞定位发现,南农大黄豆融合蛋白NGy1-GFP定位在叶绿体膜和细胞膜上,桂阳紫金豆融合蛋白GGy1-GFP主要定位在细胞膜上,所以A_1aB_1b的C末端序列端对蛋白质运输有一定的影响,推测贵阳紫金豆A_1aB_1b亚基C末端的10个氨基酸的缺失导致贮藏蛋白分泌到细胞外空间,只有少量11S贮藏蛋白质前体被转运到蛋白质贮藏型液泡中,间接导致A_1aB_1b亚基缺失。3、南农大黄豆和桂阳紫金豆Gy1基因分别编码495、386个氨基酸,利用大肠杆菌原核表达方法均获得可溶性表达的重组蛋白。HPLC纯化后可得到目的条带单一的蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定,纯化后蛋白质分子量分别为59 kDa和46 kDa。目的蛋白优化条件:大肠杆菌OD₆₀₀=0.8时诱导,IPTG诱导浓度0.5～1mmol,诱导温度30～37℃,诱导时间4～6h,摇床震荡培养转速为220 rpm。4、对来自真菌源（α-amylase from aspergillus oryae,α-amylase from bacillus subtilis）的α-淀粉酶,重组蛋白A_1aB_1b未检测到α-淀粉酶抑制活力;对来自哺乳动物源（α-Amylase from porcine pancreas-type Ⅳ,α-amylase from human salivary）的 α-淀粉酶,重组蛋白A_1aB_1b检测到相对较高的α-淀粉酶抑制活力,即重组蛋白A_1aB_1b对PPA的抑制率为58.0%,对HSA的抑制率为31.0%。纯化后的A_1aB_1b未检测到胰蛋白酶抑制剂的功能,经枯草杆菌蛋白酶处理的蛋白,其肽段对α-淀粉酶抑制活性增加。基于前人研究,分析发现此类抑制剂不同于已经报道过的六种α-淀粉酶抑制剂类型,其序列相似性较低,因此推测A_1aB_1b是一种新型贮藏蛋白类抑制剂,由于贮藏蛋白有鲜明的"Cupin"结构域,又命名为"Cupin"类型α-淀粉酶抑制剂。5、纯化后的大豆贮藏蛋白A_1aB_1b α-淀粉酶抑制剂浓度在0.7～1.5 μg/μL范围内时,对两种α-淀粉酶（PPA、HSA）的抑制能力逐渐增加。抑制剂对两种α-淀粉酶（PPA、HSA）的抑制作用最适温度是37℃,低于或高于这个温度抑制活力都有所下降。抑制剂对两种α-淀粉酶的抑制作用随共培养时间的延长逐渐增加,共培养时间达30 min时抑制率最高,超过30 min后抑制活力逐渐下降趋于平缓。抑制剂在底物淀粉浓度为1.0%时,对PPA和HSA的抑制活力最大,底物浓度超过1.0%,抑制活力迅速下降。大豆贮藏蛋白A_1aB_1b保持抑制活性最大的加热温度为37℃,65℃时抑制活力消失,这对作为保健食品的大豆蛋白粉提出了严格加热要求。抑制剂对PPA、HSA的最大半抑制浓度ID₅₀分别为2.03×10^-5 mol/L和4.7×10^-5 mol/L。大豆贮藏蛋白A_1aB_1b对PPA的可逆性抑制属于混合非竞争性抑制类型;对HSA属于不可逆抑制类型。纯化后的大豆贮藏蛋白A_1aB_1b α-淀粉酶抑制剂对马铃薯甲虫幼虫存在明显滞育现象,这些研究结果为进一步开发利用此蛋白提供了理论依据。