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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是对世界养猪业造成重大经济损失的主要传染病之一。毒株变异及病毒介导的免疫逃避和免疫抑制使得PRRS在猪场中持续流行。免疫是预防和控制PRRSV感染的主要方法。目前用于预防PRRS的主要商品化疫苗是传统的常规弱毒疫苗和灭活疫苗,但由于存在弱毒疫苗散毒和灭活疫苗免疫效果不理想等原因,使得这两种疫苗的使用都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。DNA疫苗是基于基因重组技术和免疫学的新一代疫苗,在预防和治疗疾病方面效果显著。DNA疫苗优化设计过程中加入佐剂可改善其免疫原性不足的缺点,随着免疫效果和免疫保护力的提高,为PRRSV疫苗研究带来了新的变革,具有巨大的应用推广潜力。本研究在PRRSV DNA疫苗的基础上,引入一系列佐剂,如分子佐剂(PoIFN-λ1和PoGPX-1)、递呈系统纳米颗粒佐剂(BPEI/PLGA)及粘膜佐剂(UEA-1/PLGA)等来提高DNA疫苗的免疫效果。分别制备上述四种DNA疫苗(pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5、pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5、BPEI/PLGA-pcDNA 3.1-SynORF5和UEA-1/PLGA-pcDNA3.1-SynORF5),进行小鼠和猪只免疫实验,以及猪体攻毒保护试验,通过检测GP5抗体和中和抗体滴度,淋巴细胞增殖水平,IFN-γmRNA转录水平及IFN-γ表达水平,T淋巴细胞亚型动态变化,评价疫苗免疫原性;通过检测猪只体温,临床症状,肺脏病理变化评价疫苗保护效力,进而筛选有效疫苗及佐剂,为PRRS疫苗新型佐剂的筛选和新型疫苗的研制提供新的思路。主要研究内容分为以下5部分:1、分子佐剂PoIFN-λ1对增强PRRSVDNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究以PBMCs cDNA为模板扩增出PoIFN-λ1,根据限常性酶切位点,将PoIFN-λ1插入实验室制备保存的重组质粒pcDNA3.1-SynORF5中,通过酶切鉴定和测序正确后,将质粒pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5瞬时转染Hela细胞,48h后收集裂解细胞,进行SDS-PAGE和Western blot,可以检测到大小约为48KDa的融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性。将21只6-8周龄的Balb/c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3.1,pcDNA3.1-SynORF5 和 pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5 以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5免疫组抗体滴度在首免后第14,28,42天均显著高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组(P<0.05),且首免后第42天GP5特异性抗体滴度可到1:2560,中和抗体滴度可达1:16,pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5免疫小鼠获得了较pcDNA3.1-SynORF5更强的特异性淋巴细胞增殖,其SI值分别为 1.412 和 1.126,差异显著(P<0.05),pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5 诱导IFN-y mRNA的平均表达量也显著高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组(P<0.001),分泌的IFN-y水平也最高,其含量可达395.8 pg/mL,高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y的水平(297.8 pg/mL)(P<0.05)。表明PoIFN-λ1可增强PRRSV DNA疫苗的免疫原性,具有广阔的研究前景。2、分子佐剂GPX1对增强PRRSV DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究以实验室保存的pcDNA3.1-GPX1为模板扩增出GPX1,以实验室保存的pcDNA3.1-SynORF5 为模板扩增出 LSynORF5(GPGP linker+SynORF5),根据限制性酶切位点,依次将GPX1和LSynORF5连入真核表达质粒pcDNA3.1中,通过酶切鉴定和测序正确后,将质粒pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5瞬时转染Vero细胞,48h后收集裂解细胞,进行SDS-PAGE和Western blot,可以检测到大小约为50KDa的融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性。将21只6-8周龄的Balb/c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射 pcDNA3.1,pcDNA3.1-SynORF5 和 pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5 以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:首免14天后仅DNA疫苗pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5免疫组可检测到GP5抗体,且首免后第28和42天抗体滴度也均显著高于pcDNA3.1-SynORF5 免疫组(P<0.01 和P<0.05)。首免后第 42 天 pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5诱导产生的抗体滴度平均值可高达1:5120,中和抗体滴度为1:14.86。pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5诱导小鼠脾淋巴细胞增殖(2.625)水平显著强于pcDNA3.1-SynORF5诱导的淋巴细胞增殖(1.82),差异显著(P<0.05),分泌的IFN-y含量可达404.5 pg/mL,显著高于pcDNA3.1-SynORF5免疫组(227.25 pg/mL X P<0.01)。3、纳米颗粒佐剂BPEI/PLGA对增强PRRSV DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5小鼠免疫效果的研究本研究利用改良的复乳溶剂挥发法成功制备纳米颗粒PLGA,BPEI/PLGA和SPEI/PLGA。将提取的质粒pcDNA3.1-SynORF5(下文涉及纳米颗粒佐剂处,使用DNA代表pcDNA3.1-SynORF5)吸附于各纳米颗粒表面,成功构建了 PLGA-DNA,BPEI/PLGA-DNA,SPEI/PLGA-DNA,同时也制备了 BPEI-DNA 和 SPEI-DNA。利用扫描电镜观察纳米颗粒,其形态呈球形,表面光滑无裂缝,粒径大小约100-600 nm。将49只Balb/c小鼠随机分为7组,每组7只,分别鼻饲pcDNA3.1、pcDNA3.1-SynORF5、PLGA-DNA、BPEI/PLGA-DNA、SPEI/PLGA-DNA、BPEI-DNA 和 SPEI-DNA,以评价它们诱导体液核细胞应答的能力。结果为:首免14天后仅PLGA-DNA免疫组可检测到GP5抗体。首免后第42天,PLGA-DNA诱导产生的抗体滴度平均值可高达1:5120,BPEI/PLGA-DNA 免疫组抗体滴度达 1:2560,均比 pcDNA3.1-SynORF5 免疫组高(P<0.01和P<0.05),然而BPEI/PLGA-DNA诱导产生的中和抗体滴度最高(1:19.43)显著高于DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5诱导产生的中和抗体滴度(1:10.67),差异显著(P<0.05)。淋巴增殖试验发现,BPEI/PLGA-DNA诱导产生最强的淋巴细胞增殖显著强于pcDNA3.1-SynORF5诱导的淋巴细胞增殖,差异极显著(P<0.001),分泌的 IFN-y 含量可达 678.9 pg/mL,显著高于 pcDNA3.1-SynORF5 免疫组(268.5p/mL)(P<0.001)。试验结果证实,同时作为佐剂和疫苗递呈系统的BPEI/PLGA纳米颗粒为PRRSV疫苗的研发提供新的剂型。4、粘膜佐剂 UEA-1/PLGA 对增强 PRRSV DNA 疫苗 pcDNA3.1-SynORF5 小鼠免疫效果的研究本研究利用改良的复乳溶剂挥发法成功制备纳米颗粒PLGA,并利用UEA-1修饰PLGA纳米颗粒,将提取的质粒pcDN A3.1-SynORF5或GP 5蛋白包裹于纳米颗粒内部,成功构建 UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,及不经 UEA-1 修饰的 PLGA-DNA和PLGA-GP5。将49只Balb/c小鼠随机分为7组,分别口服免疫PBS、pcDNA3.1-SynORF5、GP5、PLGA-DNA、PLGA-GP5、UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,且两周后加强免疫一次。通过检测血清IgG和肠道IgA抗体滴度评价其诱导系统免疫力和粘膜免疫力的能力。结果显示:首免后第42天,实验组UEA-1/PLGA-DNA,与UEA-1/PLGA-GP5相比,诱导产生的IgG抗体水平更高(P<0.05),抗体滴度可达到1:2560。首免后第 42 天,实验组 UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-GP5,肠道 IgA抗体滴度分别为1:960和1:1066,均与对照组呈现显著差异(P<0.01)。然而,实验组UEA-1/PLGA-DNA和UEA-1/PLGA-GP5之间无明显差异(P>0.05)。此外,离体结扎回肠循环试验表明肠上皮细胞可以捕获更多UEA-1修饰的PLGA纳米颗粒,进而递呈有效抗原至M细胞,诱导产生更为显著的粘膜免疫力。UEA-1/PLGA纳米颗粒可以作为口服疫苗的有效递呈系统得到广泛的应用。5、PRRSV DNA疫苗猪体免疫效果及免疫保护效力的研究筛选35只PRRSV抗原和抗体均为阴性的3周龄仔猪,随机分为7组,每组5头,第 1 至第 5 组分别肌肉注射pcDNA3.1-PoIFN-λ1-SynORF5、pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5、BPEI/PLGA-DNA、UEA-1/PLGA-DNA 和 UEA-1/PLGA-PRRSV 灭活苗,500 μg/只,共免疫两次,第6组肌肉注射商品疫苗JXA1-R,按说明书1头份/只,仅免疫1次,第7组为空白对照组,首免后第14,28天采血,检测GP5特异性抗体和中和抗体,以及猪外周血淋巴细胞(PBMC)增殖指数SI和T淋巴细胞动态变化,首免后第28天用HP-PRRSV JSKM强毒肌肉注射攻毒,1×105TCID50/2 mL/只,攻毒后观察临床症状,血清中病毒载量和肺脏病理变化。结果为:在所有时间点,与商品化疫苗JXA1-R免疫组相比,BPEI/PLGA-DNA诱导产生的GP5抗体低于该组诱导产生的抗体滴度,然而在首免后第28,35和49天差异不显著(P>0.05)。中和抗体水平各实验组与JXA1-R对照组类似,然而BPEI/PLGA-DNA诱导PBMC分泌的IFN-γ水平(205.78 pg/mL)高于 JXA1-R免疫组(185.89pg/mL)(P<0.05),攻毒后,猪只体温变化趋势与JXA1-R免疫组相仿,仅首免后第37和45天猪只平均体温达到40.5℃以上,肺脏病理仅表现为轻微的间质变宽。所有组别疫苗均能提供一定的免疫保护作用,BPEI/PLGA-DNA诱导产生的体液和细胞免疫可以对猪只提供较为理想的抵抗PRRSV感染的保护性免疫力。综上所述,分子佐剂(PoIFN-λ1和PoGPX-1)、递呈系统纳米颗粒佐剂(BPEI/PLGA)及粘膜佐剂(UEA-1/PLGA)能够在小鼠和猪体内增强pcDNA3.1-SynORF5诱导产生的体液和细胞免疫应答,一定程度上提高对仔猪的攻毒保护,其中BPEI/PLGA-DNA为仔猪提供的保护性免疫力最为突出。本研究通过筛选有效佐剂,为PRRSV疫苗新型疫苗的研制提供新的思路。