MG53是2009年发现的一种TRIM家族成员,又称TRIM72,是典型的包含Ring, B-box和coiled-coil3个基团的结构蛋白,在其C末端有SPRY片段。文献报道MG53只在心肌和骨骼肌表达,相对分子量为53,000Da。MG53主要分布于细胞膜下的囊泡,已发现的MG53的主要功能是参与损伤细胞膜修复,细胞膜破损刺激MG53携带小囊泡快速向损伤部位移动,囊泡通过与损伤部位膜融合对损伤膜进行修复。MG53甚至可以从细胞外对损伤的细胞膜进行修复.大量研究表明MG53与细胞膜的损伤修复密切相关,一旦细胞膜发生损伤,MG53就会联合caveolin-3(小窝蛋白3),通过感知细胞内的氧化环境的变化,促进带有MG53的小囊泡向受损的部位募集并从细胞膜出芽,从而以膜片的方式进行修复。瞬间外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)是心肌细胞膜上广泛存在的电压依赖性的快速激活/快速失活K+电流,参与心脏动作电位1期复极化,对动作电位时程(action potential duration, APD)以及Ca2+内流起重要调控作用。多种病理条件如心肌肥大、心肌梗死、糖尿病等,都可能引起APD延长,QT间期离散,从而造成室性心律失常甚至心脏猝死,已证实其发生机制与Ito功能下调有关。KChIP2是心脏瞬间外向钾电流Ito的必须β亚基,对其功能起不可或缺的调节作用。KChIP2还决定Ito的发育变化特性和在心室壁的跨壁梯度,对维持心脏电稳态至关重要。KChIP2的表达水平与Ito的病理调节密切相关,心肌肥大,梗死性心肌病和心衰等多种心脏疾病均引起Ito功能下调,相应的,心肌KChIP2表达明显降低,表明KChIP2异常是引起疾病心脏Ito功能下调的一个重要机制,上调KChIP2表达水平对相应的心脏疾病具有很好的治疗作用,但KChIP2的生理和病理调节机制尚待查明。现已在MG53敲除小鼠发现,Kv2.1介导的钾电流减小,AP异常和心律失常,表明MG53这一心脏特异性表达基因在心电稳定性维持中起重要作用。但目前仅此一篇文章报道了MG53在心脏离子通道和心电稳定性的作用,MG53对维持心电稳态至关重要的瞬间外向钾电流Ito离子通道的作用和机制尚未展开深入研究。预实验发现,过表达MG53增加心肌细胞KChIP2蛋白和Ito电流,降低MG53表达则起相反作用,表明MG53是心脏内在的KChIP2调节分子。据此,本项目拟开展以下研究：1.MG53在成年大鼠和乳鼠心肌细胞对KChIP2和Ito的调控。2.MG53对成年大鼠心肌细胞钙信号的调控。3.MG53调控KChIP2表达的分子机制.以此阐明心脏电稳态调节的新机制,探寻心律失常治疗的新靶点。方法：采用培养的成年大鼠及新生乳鼠心肌细胞,用携带MG53和GFP基因的腺病毒转染心肌细胞,增加心肌细胞MG53表达(Ad-MG53),或用携带抑制心肌细胞MG53表达的寡核苷酸的腺病毒(RNA干扰)转染心肌细胞,降低MG53表达(Ad-MG53-RNAi),分别采用携带GFP基因的腺病毒(Ad-GFP)或携带scramble寡核苷酸的腺病毒(Ad-ShRNA)作为MG53过或低表达的对照,转染48小时通过Western blot定量分析MG53表达量以明确MG53过或低表达成功与否,进而研究MG53对心肌细胞自身离子通道的功能和电生理特性的调节作用及其相关机制。第一部分 MG53对心肌细胞离子通道Ito功能和电生理特性的调节作用在此,我们用腺病毒过表达MG53或RNA干扰技术降低MG53的表达,观察MG53对心肌电生理的影响。结果表明：1.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)功能的调节1.1 MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电流密度和门控动力学的影响乳鼠心肌细胞转染四种腺病毒,48h后膜片钳记录Ito电流。结果表明,较Ad-GFP组相比,Ad-MG53组Ito电流密度显著增加,增加了1.1倍(P=0.00<0.05),即过表达MG53能显著增加Ito电流密度；较Ad-ShRNA组相比,Ad-MG53-RNAi组Ito电流密度显著降低,降低了38%(P=0.00<0.05)。即抑制MG53表达能显著降低Ito电流密度。MG53的不同表达对Ito通道的激活动力学无显著影响,在+60mV所产生电流达到峰值的时间(time to peak, TTP)没有统计学差异。同时,过表达MG53能显著减慢Ito通道的失活动力学,使Ito通道电流衰减的时间延长,Ad-MG53组电流峰值衰减一半的时间To.5较Ad-GFP组显著延长(P=0.04<0.05),有统计学意义；抑制MG53的表达,T0.5较对照组显著缩短(P=0.03<0.05),即MG53影响Ito的失活动力学。成年大鼠心肌细胞转染四种腺病毒,48h后膜片钳记录Ito电流。结果表明,较Ad-GFP组相比,Ad-MG53组Ito电流密度未发生明显改变;较Ad-ShRNA组相比,Ad-MG53-RNAi组Ito电流密度显著降低,降低了25.4%(P=0.00<0.05)。即抑制MG53表达能显著降低Ito电流密度。MG53的不同表达对Ito通道的激活动力学无显著影响,在+60mV所产生电流达到峰值的时间(time to peak, TTP)没有统计学差异。同时,过表达MG53能显著减慢Ito通道的失活动力学,使Ito通道电流衰减的时间延长,Ad-MG53组电流峰值衰减一半的时间T0.5较Ad-GFP组显著延长(P=0.008<0.05),有统计学意义；抑制MG53的表达,T0.5较对照组显著缩短(P=0.02<0.05),即MG53影响Ito的失活动力学。1.2.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性激活的影响乳鼠心肌细胞：Ad-MG53组电流密度在0-+70 mV的电压范围内均显著高于Ad-GFP组(P<0.05)。Ad-GFP组与Ad-MG53组电压依赖性激活曲线发生变化,曲线负向移位,Vo.5,act分别为34.26±1.85 mV和27.61±1.99 mV,P=0.03<0.05,k值两组之间无统计学意义,说明MG53不改变Ito的离子选择性。抑制MG53表达,在+10～+70 mV电压范围内,较Ad-ShRNA组相比,Ad-MG53-RNAi组Ito电流密度显著降低(P<0.05),电压依赖性激活曲线发生变化,曲线正向移位,V0.5.act分别为32.68±2.19 mV和42.04±3.15 mV,P=0.03<0.05,k值两组之间无统计学意义,说明MG53不改变Ito的离子选择性。成年大鼠心肌细胞：Ad-MG53组电流密度在-40～+70 mV的电压范围内和Ad-GFP组无统计学差异(P>0.05)。Ad-GFP组与Ad-MG53组电压依赖性激活曲线未发生移位,V0.5,act分别为29.97±1.84 mV和34.05±2.09 mV,P=0.15>0.05,k值两组之间无统计学意义,说明MG53不改变Ito的离子选择性。抑制MG53表达,在+20～+70 mV电压范围内,较Ad-ShRNA组相比,Ad-MG53-RNAi组Ito电流密度显著降低(P<0.05),电压依赖性激活曲线未发生变化,V0.5,act分别为33.80±1.23 mV和33.11±1.61 mV, P=0.74>0.05, k值两组之间无统计学意义,说明MG53不改变Ito的离子选择性。1.3.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性失活的影响乳鼠心肌细胞：过表达MG53,电压依赖性失活曲线正向移位,k值不变。抑制表达MG53,电压依赖性曲线未发生明显变化,K值不变,即MG53不改变Ito的离子选择性。成年大鼠心肌细胞：过表达MG53,电压依赖性失活曲线未发生移位,k值不变。抑制表达MG53,电压依赖性曲线负向移位,K值不变,即MG53不改变Ito的离子选择性。2.MG53对心肌细胞动作电位时程(APD)的影响Ad-MG53组APD20, APD50, APD90均较Ad-GFP组显著缩短(P<0.05),静息膜电位RMP没有发生改变。而Ad-MG53-RNAi组APD20和APDso较shRNA组显著延长(P均<0.05),而RMP也没有发生改变。第二部分MG53对成年大鼠心肌细胞钙信号的调节作用单个心肌细胞由于动作电位时程(action potential duration, APD)的改变影响Ca2+内流,从而改变兴奋-收缩偶联时钙稳态进而影响心脏的舒缩功能。本实验本实验使用腺病毒载体技术,将MG53基因转染入分离培养的成年大鼠心肌细胞,使其超量表达以观测MG53蛋白在心肌收缩中的作用,并使用siRNA干扰技术实现反向调节,降低MG53蛋白表达,观测MG53表达低于生理水平时,是否可将MG53的效应逆转,共聚焦显微成像技术对细胞内钙信号进行研究。研究发现：过表达MG53,增加成年大鼠心肌细胞静息钙水平,钙瞬变增强,细胞收缩力增大。反之,抑制表达MG53,细胞静息钙水平降低,钙瞬变减弱,细胞收缩力减小。第三部分MG53调控辅助亚基KChIP2表达的机制1.利用大规模高通量新一代测序技术平台(Hiseq2000),采用50SE测序策和Illumina Sequencing Kits v3,对Ad-GFP、Ad-MG53、Ad-ShRNA、 Ad-MG53-RNAi四组RNA样品进行Hiseq测序,筛选出过表达和低表达中呈相反趋势变化的基因,结果发现：MG53调控KChIP2表达。2.MG53不同表达对瞬间外向钾通道(Ito)β亚基KChIP2表达的影响Western blot结果表明：不论是乳鼠心肌细胞,还是成年大鼠心肌细胞,过表达MG53, KChIP2蛋白表达量显著增加,抑制MG53表达,KChIP2蛋白的表达量显著降低。结果表明,MG53上调Ito的一个重要机制是增加其β亚基KChIP2的表达量。3.免疫荧光发现,抑制MG53的表达,NF-κB活化入核。4.构建抑制NF-κB磷酸化的质粒,IκB-α的突变体,转染乳鼠心肌细胞48小时,IκB-α能显著抑制MG53降低引起的KChIP2表达水平的降低,同时能够抑制MG53降低引起的NF-κB的升高,从而提示：MG53调控KChIP2的表达,与NF-κB信号通路相关。NF-κB的化学抑制剂BAY-117082具有和IκB-α-mutant以的效应。5.对不同发育阶段大鼠心脏MG53蛋白水平定量分析发现,MG53具有与KChIP2相似的发育特性,其表达也随着心脏的发育逐渐增加。6.MG53在不同组织的表达。如前所报道,MG53在肝脏、肾脏器官未见表达,在心脏和骨骼肌大量表达。除此之外,MG53的表达还见于子宫和血管。结论：1.调控MG53表达,能够改变瞬间外向钾通道(Ito)电流密度,能够使Ito的电压依赖性失活曲线发生移位,但不改变Ito的离子选择性。2.调控MG53表达,能够改变成年大鼠心肌细胞动作电位的时程。3.调控MG53表达,影响成年大鼠心肌细胞静息钙水平、钙瞬变和心肌收缩力。4.MG53调控KChIP2表达,与NF-κB信号通路相关。5.MG53具有与KChIP2相似的发育特性,其表达也随着心脏的发育逐渐增加。6.MG53表达不限于骨骼肌和心肌细胞,在平滑肌细胞也有表达。