论文部分内容阅读
植物在整个生命过程中无时不刻感知外界信号并做出一系列细胞内反应以响应不断变化的外界环境、细胞外信号和微生物的入侵。多年研究发现胞外富含亮氨酸重复序列(Extracellular leucine-rich repeats,eLRR)结构域的类受体蛋白(Receptor-like protein,RLP)和类受体激酶(Receptor-like kinase,RLK)在该过程中发挥着重要作用。RLP和RLK可形成蛋白复合物共同接受CLE(CLV3/Embryo surrounding region-related)多肽信号,通过调节WUSCHE(WUS)家族基因的表达参与调控茎尖分生组织、根尖分生组织和维管形成层稳态的维持。拟南芥RLP家族有57个成员,绝大部分RLP基因在基因簇中串联重复排列;大部分RLP基因T-DNA插入突变体没有可见表型,可能是由于同源蛋白间功能的冗余性造成。本实验采取体内超表达RL尸基因的策略寻找与发育和抗病相关的RLP。本实验构建了 35个超表达RLP基因载体并转化Col-0/Ler及相关突变体成熟植株,收获42个T1代转基因种子,22个T2代种子和4个T3代纯合体种子。初步确认RLP28是一个参与了植物抗病和抗逆的关键基因,可能参与了不同环境胁迫的cross-talk(结果在本论文中未展示);超表达RLP33基因可对植物的发育产生影响(结果在本论文中未展示);RLP3和RLP11与同源蛋白RLP2和RLP12 一样,具有调控拟南芥分生组织干细胞增殖和发育的功能,证明了同源基因编码功能相同的蛋白,验证了RLP基因的功能冗余,说明通过超表达RLP基因可有效帮助寻找RLP新功能。同时,我们获得的超表达RLP的转基因植物为更进一步分析RLP蛋白的功能累积了丰富的遗传材料。RLP基因测序比对结果显示,7个克隆的RLP基因的序列TAIR数据库和(或)NCBI数据库对应序列存在差异,暗示这7个RLP基因在体内可能存在多种剪接方式。10个RL尸基因的序列与TAIR数据库对应序列相一致,但和NCBI数据库中的存在差异;9个RLP基因的序列与TAIR数据库和NCBI数据库对应序列完全一致。存在可变剪接的RLP基因引起编码阅读框的移位,引入新的终止密码子最终造成蛋白翻译的提前终止,暗示可变剪接可能会引起RLP功能的改变。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点广泛分布于拟南芥20种生态型54个RLP基因中,且不同基因不同生态型间SNP位点数目不一。根据发生突变的形式,可分为4个类型,分别为:一、该非同义突变位点只为某一RLP基因一种生态型所有;二、该非同义突变位点形成终止密码子;三、编码同一氨基酸的密码子不同位置上的碱基存在同义突变和(或)非同义突变;四、该SNP位点同时存在同义突变和非同义突变。分析SNP位点在RLP上的分布规律发现,SNP主要分布在RLP蛋白LRR结构域,其中又以非同义突变为主。以RLP2为例分析SNP位点重要性发现第195位氨基酸T和第445位氨基酸L对应β-链中亮氨酸L的位置,且该位点碱基的改变可引起蛋白构象的变化,进而影响RLP2蛋白功能。拟南芥CLE家族共有32个成员,编码26种成熟CLE多肽,根据是否参与调控茎尖分生组织和根尖分生组织干细胞的增殖与分化过程可将CLE多肽分为A和B两类,A类CLE多肽调控茎尖分生组织和根尖分生组织干细胞的增殖与分化,而 B 类 CLE 多肽不参与该过程的调控。TDIF(Tracheary element differentiation inhibitory factor)多肽抑制导管分子的形成,其氨基酸序列和B类多肽CLE41/44相同。CLE41多肽由维管组织韧皮部细胞分泌,被在形成层细胞表达的受体PXY/TDR(Phloem intercalated with xylem/TDIF receptor)所识别,通过调节WOX4基因的表达以促进形成层干细胞的增殖并抑制干细胞分化为木质部细胞。与CLE41基因进化相近的SdCLE基因在成熟植株茎基部维管组织木质部细胞中特异表达。研究发现SdCLE基因在幼苗时期主要在根中柱中表达,同时在下胚轴、子叶、表皮毛和侧根根端也均有表达。ATHB8pro:GUS标记原形成层细胞和初生木质部细胞,外施SdCLE多肽和第六位氨基酸甘氨酸(G)突变为苏氨酸(T)的SdCLEG6T多肽造成ATGB8pro:GUS表达的提前,表明第六位氨基酸G突变为T对SdCLE多肽的功能没有影响;TMO5pro:GFP标记木质部细胞,外施SdCLE多肽造成TMO5pro:GFP的GFP信号密度和层数增加,表明在SdCLE多肽处理促进形成层干细胞分化为木质部细胞。超表达SdCLE基因引起茎基部维管组织韧皮部区域出现木质化细胞结构,但木质部细胞数目和结构均不发生改变,同时形成层细胞层数增加,表明SdCLE多肽参与细胞木质化过程并促进形成层干细胞分裂。超表达SdCLEG6T基因同样引起茎基部维管组织韧皮部区域出现木质化细胞结构,并且明显改变维管组织细胞排列,但不增加形成层细胞层数,这与SdCLE多肽和SdCLEG6T多肽处理marker lines出现相同结果不同,SdCLEG6T基因具有与正常SdCLE基因相同的作用且效果更为明显,可能是由于化学合成多肽由于没有经过第七位脯氨酸羟基化活力不如体内合成多肽活力高的原因,同时,第六位氨基酸G突变为T不改变SdCLE多肽功能,某种程度上还可增强SdCLE多肽功能。