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叶酸受体a (FOLR1)是细胞摄取叶酸的高亲和性受体,课题组前期研究发现FOLR1的表达与鼻咽癌的发生及紫杉醇耐药表型密切相关,而FOLR1引起的鼻咽癌紫杉醇耐药表型似乎与其具有叶酸转运的功能无关。本文将以鼻咽癌亲本细胞系和紫杉醇耐药细胞系为研究对象,从蛋白质之间的相互作用为切入点,探索FOLR1的作用通路与鼻咽癌紫杉醇耐药之间的相关性。首先以FOLR1多克隆抗体为诱饵通过免疫共沉淀技术筛选其相互作用蛋白,初步确定了在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1的相互作用蛋白——角蛋白17(Cytokeratin17,CK17),接着用免疫共沉淀、Western Blot、免疫荧光共定位等技术鉴定相互作用蛋白质,确定在鼻咽癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞中FOLR1与CK17存在功能上的蛋白质间相互作用。通过生物信息学网络分析相互作用蛋白的作用机制,分析FOLR1可能的作用通路,发现二者之间有一个共同的相互作用蛋白——泛素C(ubiquitin C,UBC),二者的相互作用蛋白涉及细胞分化、细胞周期、DNA修饰、信号转导等功能。然后再通过siRNA干扰技术沉默FOLR1或CK17,检测作用通路分子的活化情况,发现沉默FOLR1基因,CK17在转录与蛋白水平表达均下调,而沉默CK17基因,FOLR1的表达无变化,分析FOLR1引起的鼻咽癌紫杉醇耐药表型可能通过FOLR1与CK17间的相互作用这条作用通路,而二者间的相互作用可能通过UBC起作用。我们推断鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1表达的增高,可能是通过蛋白质的相互作用,诱导和调节与肿瘤细胞生长或凋亡相关的信号分子而发挥作用。图45幅,表21个,参考文献87篇1FOLR1的相互作用蛋白筛选目的：筛选人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1的相互作用蛋白。方法：以免疫共沉淀、SDS-PAGE电泳和凝胶染色方法筛选体外培养的正常鼻咽上皮细胞NP69和三株鼻咽癌紫杉醇耐药细胞(CNE-1/Taxol、CNE-2/Taxol、HNE-2/Taxol)中FOLR1的相互作用蛋白,质谱分析方法鉴定相互作用蛋白。结果：CNE-2/taxol细胞蛋白质经过FOLR1的抗原抗体复合物及Protein A琼脂糖珠的共沉淀后,与对照比较,有5条差异条带,分子量分别约为120kD,58kD,50kD,44kD,30kD; CNE-1/taxol10细胞蛋白质经免疫共沉淀后电泳,与对照比较,有3差异条带,分子量分别约为60kD,55kD,50kD; CNE-1/taxol13细胞蛋白质经免疫共沉淀后电泳,与自身对照比较,有2差异条带,分子量分别约为50kD,36kD。结合3次免疫共沉淀实验结果,不同凝胶上都显示出-50kD的差异条带,预示SDS-PAGE凝胶上-50kD的蛋白质可能是与FOLR1相互作用的蛋白质。通过对差异条带进行飞行质谱分析,结果显示该蛋白质为cytokeratin17。结论：人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1蛋白可能与CK17蛋白有相互作用。2FOLR1与CK17蛋白相互作用的验证目的：验证筛选出来的FOLR1的相互作用蛋白CK17,确定二者在生理条件下存在相互作用。方法：以免疫共沉淀、Western blot方法验证鼻咽癌亲本细胞(CNE-1)及鼻咽癌紫杉醇耐药细胞(CNE-1/Taxol)中FOLR1与CK17是否存在相互作用；免疫荧光双标法分析FOLR1与CK17的共定位关系；运用Visant软件对生物信息网络数据库进行检索和分析,确定FOLR1和CK17已知的可能相互作用蛋白。结果：1.以FOLR1抗体对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/taxol的总蛋白进行免疫共沉淀后,复合物中可以检测到CK17的表达,阴性对照中没有检测到CK17的表达。2.以CK17抗体对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/taxol的总蛋白进行免疫共沉淀后,复合物中可以检测到FOLR1的表达,而在对照细胞NP69中没有检测到FOLR1的表达。3.免疫荧光激光共聚焦显微镜观察到FOLR1蛋白在细胞浆及细胞膜中均有表达,CK17蛋白在细胞浆中较强表达,两种蛋白在胞浆中融合。4.生物信息网络Visant软件搜索发现,FOLR1的相互作用蛋白有5个,分别是LYN、UBC、NCAPH2、IRAK3、CUL3、CK17的相互作用蛋白有16个,分别是UBC、YWHAQ、KRT8、KRT72、SNAPAP、 KRT7、EGFR、CCDC85B、KRT6A、APC、GABARAP1、GRB2、 USP1、UCHL1、COPS5、SUM02。2种蛋白质具有共同的相互作用蛋白质,泛素C (Ubiquitin C)结论：1.在鼻咽癌细胞和鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1与CK17存在物理上的相互作用。2.FOLR1与CK17有一个共同的相互作用蛋白——泛素C。3FOLR1与CK17的功能相互作用目的：通过RNA干扰技术抑制FOLR1或CK17基因表达后,观察信号通路的基因表达变化。方法：采用real time PCR、Western blot方法检测CK17在鼻咽癌亲本细胞(CNE-1)及其紫杉醇耐药细胞(CNE-1/Taxol)中的表达水平；通过RNA干扰技术,沉默CNE-1细胞中CK17的表达,观察FOLR1的变化；沉默CNE-1/Taxol细胞中FOLR1的表达,观察CK17的变化；基因芯片技术分析FOLR1基因沉默后耐药细胞基因组的mRNA表达变化。结果：CK17mRNA和蛋白在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol中表达明显减弱；鼻咽癌细胞CNE-1的CK17基因表达被降低后,FOLR1基因的表达无显著变化；然而,鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol的FOLR1基因被降低后,CK17基因的mRNA及蛋白表达水平也显著下调。cDNA Microarray基因芯片结果显示,FOLR1基因沉默后,与FOLR1有相互作用的5个基因表达均下调1.0-1.7倍,CK17表达下调约2.5倍。结论：1. Cytokeratin17在人永生化鼻咽上皮细胞、鼻咽癌亲本细胞、鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中表达。2.与鼻咽癌亲本细胞CNE-1比较,CK17在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol中的表达显著降低,可能与鼻咽癌紫杉醇耐药相关。3. FOLR1在鼻咽癌细胞中与CK17存在蛋白质相互作用,可能通过影响其下游的信号通路,促进肿瘤细胞生长,抑制细胞凋亡,在鼻咽癌紫杉醇耐药中发挥重要作用。