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手足口病是一种病毒性传染病,由肠道病毒引起的,主要的病原体是肠病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox A16)。婴幼儿及学龄前儿童易感。少部分的手足口病例可并发严重的神经系统疾病,包括脑膜炎、病毒性脑炎、肢体麻痹等,甚至导致死亡。所以该病的早期诊断显得非常重要。本研究拟建立手足口病的病毒核酸和血清抗体检测方法,并对其进行初步的临床评价。目的：建立一种能同时检测肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型等手足口病病原体核酸的实时荧光PCR方法；在原核表达系统中对肠道病毒71型基因进行克隆、表达、纯化,建立血清中IgM抗体的检测方法；并进一步评估人肠道病毒71型IgM抗体在手足口病早期诊断中的价值。主要方法：1、根据肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型等手足口病病原体核酸的基因序列,设计、合成引物和探针,对38例手足口病患者在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT-PCR方法的检测结果进行比对。2、采用RT-PCR的方法,分离EV71 VPl基因；将该片段插入表达载体pRSET-A,在大肠杆菌中进行表达,利用纯化后的表达产物,建立检测EV71 IgM抗体的酶联免疫吸附试验,对31例临床诊断为手足口患儿及36例健康儿童血清进行了检测。3、自发病后连续每日采集2010年我院收治的38例手足口病患儿血清及咽拭子标本,分别检测EV 71 IgM抗体、肠道病毒核酸、EV 71病毒核酸。结果：1、38例患者肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型实时荧光PCR方法阳性率分别为：73.7%,61.0%,13.2%,常规RT-PCR方法的阳性率分别为：71.1%,55.3%,13.2%。统计分析表明,实时荧光PCR方法与常规RT-PCR检测结果差异不具统计学意义。2、PCR产物及重组蛋白大小分别约为910bp及33KD,与预期VP1全基因及蛋白片段大小一致。ELISA检测结果显示在手足口患儿中有7例呈阳性,健康组中未发现阳性,差异具有统计学意义。3、38例手足口病患儿IgM抗体,按发病天数累加阳性率分别为：第1天60.5%、第2天71.1%、第3-4天81.5%、第5天92.1%、第6天92.1%；肠道病毒核酸阳性率为73.6%；EV 71特异核酸阳性率为60.5%。结论：1、建立了实时荧光PCR检测HFMD病原体EV 71、COX A16、EV的方法,且该方法在对病毒核酸检测的灵敏度与特异性方面与常规RT-PCR吻合度较高,两种方法具有一致性。2、成功建立了EV71 IgM抗体的检测方法。3、EV 71 IgM抗体在手足口病发病的第1天即可出现,至第5天阳性率达到峰值,可作为手足口病早期诊断指标之一。