生物膜(biofilm)是细菌在组织、物体表面聚集、粘附,用胞外大分子包裹自身的进行复杂的生理代谢活动的微生态结构。胞外基质(extracellular polymeric substances,EPS)中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA等成分。有一族与DNA具有较高亲和力的蛋白,DNA结合蛋白家族(DNABII),这族蛋白包括类组蛋白HU和一些如革兰氏阴性菌中表达的集合宿主因子蛋白IHF,在变形链球菌中仅有类组蛋白HU。DNABII蛋白家族通过结合DNA交联形成立体结构,对生物膜的发生发展过程起了重要的作用。有关于大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌的研究结果表明,靶向DNABII家族蛋白的抗血清可以使生物膜结构破坏,从而使细菌从生物膜中暴露,再进行抗菌药物的联合使用来达到抗菌治疗的效果。我们通过制备HU的特异性抗体来针对变形链球菌生物膜进行研究。研究目的探究变形链球菌作为生物膜的存在形式在口腔牙齿龋病发生发展中的作用机制。借助变形链球菌生物膜体外模型分析变形链球菌的粘附、聚集以及生物膜的形成发育,实验研究生物膜形成的环境条件、蛋白因子等相关因素如何介导变型链球菌引起龋病的发展。重组表达变形链球菌HU蛋白,并以此制备HU特异性抗体进行对HU蛋白对变形链球菌生物膜形成的作用机制。研究方法1、运用细菌在96孔板上生物膜形成模型。厌氧条件下用加有蔗糖的脑心浸液培养基BHI培养变形链球菌,在96孔板上形成体外的生物膜结构,运用结晶紫染色法对生物膜内细菌进行细胞核的染色,乙酸洗脱浸染的结晶紫,用酶标仪读取洗脱液的OD值来评估生物膜形成的量。2、对变形链球菌全基因组中编码HU蛋白的基因片段进行分子克隆,使用带有酶切的特异性引物进行PCR得到HU基因片段,用限制性内切酶、DNA连接酶处理PCR产物构建出pET-28a-HU表达载体,转化入BL21(DE3)感受态细胞中运用原核表达系统重组表达变形链球菌的HU蛋白。3、以HU蛋白免疫大耳白兔来获得免疫血清,再通过HU蛋白结合树脂柱进行免疫血清中HU多克隆抗体的纯化。同时,运用噬菌体抗体展示库技术以重组表达的HU蛋白为抗原进行单克隆抗体的筛选。获得的单克隆抗体和多克隆抗体进行ELISA和western blot实验评估抗体与HU的亲和力。4、将抗体引入96孔板变形链球菌体外生物膜模型中,对处理组和空白对照组的生物膜形成进行对比和结晶紫染色所得的OD值进行统计学分析。研究结果1、变形链球菌在96孔板上的体外生物膜形成,培养基中的蔗糖成分是必不可少的,蔗糖不仅仅为变形链球菌的增殖生长提供能量,还对生物膜的形成有结构上的重要性,变形链球菌生物膜形成量随着蔗糖的浓度增高而增多,而缺失蔗糖的情况下即使在培养中提供额外的葡萄糖,变形链球菌也无法形成生物膜。2、成功从变形链球菌ingbritt株的全基因组中分子克隆出HU基因片段,同时在PCR上下游引物设计增加了酶切位点,获得了上下游分别带有BamHI、XhoI酶切位点的HU片段,运用限制性内切酶和T4连接酶成功构建了 pET-28a-HU表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞中得到了 HU蛋白重组表达工程菌。实验结果表明,在37℃,0.1mM IPTG的诱导下,工程菌可以成功表达HU蛋白,并且主要存在于细胞超声裂解液的上清中。3、成功通过以HU重组表达蛋白为抗原免疫大耳白兔获得免疫血清,并以此纯化出HU的多克隆抗体,ELISA和western blot试验显示所得多克隆抗体能与HU特异性结合。噬菌体抗体展示库的抗体筛选,在经过5轮的吸附、淘选、富集、感染获得了 一组抗体轻重链序列,然而经过重建抗体轻重链表达载体并进行293E细胞转染后,表达出的单克隆抗体与HU无亲和力,是为假阳性结果。4、在0.5g/1的蔗糖浓度下,变形链球菌的生物膜形成,HU多克隆抗体处理组比空白对照组的生物膜形成量有一定程度的降低。结 论本研究对变形链球菌体外生物膜模型进行了蔗糖浓度的调整,原浓度在生物膜形成过程中为过量状态,蔗糖较小程度的增多与减少与其他因素对生物膜形成的速率与结果的影响可能被蔗糖的浓度所代偿。现浓度为较低浓度,当引入处理因素时,可以更为灵敏。我们进行分子克隆重组表达了变形链球菌的HU蛋白,并以此为抗原获得了能特异结合HU的多克隆抗体。将此多克隆抗体作为处理因素引入变形链球菌在较低蔗糖浓度生物膜实验中,发现变形链球菌生物膜形成被一定程度的抑制。