研究背景近年来有研究表明细胞因子与肿瘤的发生、发展有重要关系,急性白血病是来源于血液系统的恶性肿瘤,细胞因子的表达与调控异常可能参与了白血病的发生及发展过程,如细胞因子能发挥抗肿瘤作用,但肿瘤细胞也可通过分泌抑制性细胞因子抑制机体免疫细胞的功能,导致宿主处于免疫功能低下状态或免疫抑制状态,从而在免疫应答诱导和效应的多个环节上抑制机体抗肿瘤免疫应答。细胞免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用,已证实其在白血病发生、发展过程中起重要作用。但目前白血病病因及发病机制尚未完全阐明,由于该病对家庭和社会带来沉重的经济和精神负担,也严重影响患儿日后的生活质量,为了进一步提高白血病患儿生活质量,有关白血病发病机制和特异性治疗措施的探讨已成为当今儿童急性白血病领域研究热点之一。理论上讲机体发生炎症反应时,炎症局部可产生白介素等细胞因子促进中性粒细胞渗出到炎症局部,说明细胞因子与感染有密切关系。临床工作中国内外也已有较多研究证实细胞因子与感染之间紧密联系,研究热点定位在粒细胞缺乏症合并感染早期诊断指标及预后的预测指标,临床工作中若要进一步提高儿童急性白血病的治愈率必须提高中性粒细胞减少症合并感染的治愈率,因为中性粒细胞减少症合并感染是移植后或化疗后白血病病人死亡的主要原因,粒细胞缺乏症合并感染的急性白血病患者缺乏特异症状,血培养等因各种技术条件的限制,对临床指导意义有限,目前在临床工作中难以早期判断粒细胞缺乏症合并感染的急性白血病患者感染类型,很难针对性使用抗生素,因此,有必要寻找早期判断粒细胞缺乏症合并感染的预测指标,而细胞因子则是可能的早起预测指标之一,故本研究进一步研究细胞因子作为临床早期诊断、预防严重感染的指标提供理论基础,针对性使用抗生素,避免抗生素等医疗资源的浪费。研究目的1.1研究儿童急性白血病大剂量化疗前后免疫微环境的变化,探讨化疗前后免疫重建过程中C-反应蛋白、白介素(IL)-6、白介素-8、干扰素(IFN)-γ变化规律及其相关关系的临床意义,为其可以作为儿童急性白血病治疗反应的监测指标提供理论依据。1.2从细胞因子的角度探讨中性粒细胞减少症合并感染的儿童恶性血液病患者血清中细胞因子的变化水平及临床意义,主要就儿童急性白血病化疗后出现粒细胞缺乏症合并感染前后C-反应蛋白(CRP)、IL-6,IL-8,IFN-γ的变化规律、相关关系的临床意义,及其与感染的发生发展之间的关系,为临床早期诊断、预防严重感染提供依据。研究方法1.1本着知情、自愿原则从南方医科大学南方医院儿科病房中选择40例符合本研究标准的急性白血病患儿,分别在以下时间点化疗前的基础值(T0)；化疗后3天(T1)；粒细胞缺乏症合并发热后第1天(T2)、第3天(T3)、第7天(即抗生素使用第7天,T4)、化疗后缓解期(T5)采集血标本。1.2采集血标本分别进行下述检测：(1)在南方医科大学南方医院检验科,使用SYSMEX XE5000血液分析仪及配套试剂,采用血细胞五分类分析,计数上述不同时间点中性粒细胞绝对值(单位109/L)；(2)在南方医科大学南方医院检验科,严格按照罗氏全自动电化学发光免疫分析仪ROCHE COBAS6000仪器及ROCHE配套试剂的常规操作步骤,使用免疫比浊法检测上述不同时间点的CRP水平,CRP的正常值<5mg/L;(3)在南方医科大学珠江医院肾移植免疫学实验室,采用液相芯片技术(美国Bio-plex悬浮蛋白芯片系统,本研究使用该公司Bio-Plex human cytokinemulti-plex试剂盒、Bio-Plex cytokine reagent试剂盒及检测仪器),检测上述不同时间点细胞因子水平(包括IL-6、IL-8、IFN-γ),液相芯片技术可同时检测同一标本中的多种细胞因子,在不同荧光编码微球上进行抗原+抗体、配体+受体、酶+底物、核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的。液相芯片技术检测细胞因子共分为三步：第一步：探针分子的固定；第二步：检测反应；第三步：激光分析。数据分析应用了Bio-Plex的管理软件(version4.0),其敏感性在10pg/ml以下,能够准确检测的细胞因子浓度范围是1-32000pg/ml。1.3统计学方法及数据处理：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,计量资料均用均数±标准差表示,各组数据均进行正态性检验,IL-6、IL-8、IFN-γ同一指标各时间点两组间比较采用两相关样本符号秩和检验,CRP各时间点两组间比较采用两相关样本t检验。IL-6、IL-8、IFN-γ和CRP两指标间相关分析采用双变量相关分析,CRP与IL-6之间相关关系采用积矩相关系数(Pearson相关系数),其余两指标间比较均采用等级相关系数(Spearman相关系数),P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、大剂量化疗前后CRP、IL-6、IL-8、IFN-γ的变化：1.1CRP、IL-6、IL-8、IFN-γ结果均使用均数±标准差表示, T0、T1、T5时相CRP值分别为(4.51±8.42) mg/L、(4.82±8.54)mg/L、(19.82±36.86)mg/L；T0、T1、T5时相IL-6值分别为(5.39±7.42)pg/ml、(6.45±9.69) pg/ml、(6.45±9.69) pg/ml; T0、T1、T5时相IL-8值分别为(72.38±135.04)pg/ml、(20.76±48.37) pg/ml、(20.76±48.37) pg/ml; T0, T1、T5时相IFN-γ值分别为(71.24±18.48) pg/ml、(56.47±27.08) pg/ml、(56.47±27.08) pg/ml。1.2CRP、IL-6浓度化疗后3天(T1)、化疗后缓解期(T5)与化疗前的基础值(T0)相比较差异均无统计学意义(P>0.05)；To与T1时相相比较,IFN-γ、IL-8浓度差异有统计学意义(P值分别为0.005,0.002),T0与T5、T5与T1相比较IFN-γ、IL-8浓度变化差异均无统计学意义。1.3T0、T1、T5时相IL-6、IL-8、IFN-γ、CRP之间均无相关性(P>0.05)。2、粒细胞缺乏症合并发热时CRP、IL-6、IL-8、IFN-γ的变化：2.1CRP、IL-6、IL-8、IFN-γ结果均使用均数±标准差表示,T2、T3、T4时相CRP值分别为(36.0±39.73)mg/L、(24.86±39.88)mg/L、(24.19±45.08)mg/L；T2、T3、T4时相IL-6值分别为(30.18±64.6)pg/ml、(17.65±33.93)pg/ml、(15.49±25.08)pg/ml；T2、T3、T4时相IL-8值分别为(14.94±14.8)pg/ml、(15.67±13.8)pg/ml、(18.35±16.25)pg/ml；T2、T3、T4时相IFN-γ值分别为(74.45±16.78)pg/ml、(66.19±16.43)pg/ml、(61.83±23.59)pg/ml。2.2粒细胞缺乏症合并发热后第1天(T2)、第3天(T3)与化疗前的基础值(T0)相比,CRP水平变化均有统计学意义(P<0.05)。T2、T3、T4中位值水平明显较化疗前的基础值To升高,出现发热后24小时CRP水平升至最高峰。粒细胞缺乏症合并发热后第7天(T4)与化疗前的基础值(T0)、粒细胞缺乏症合并发热后第1天(T2)、第3天(T3)相比,CRP水平变化差异均无统计学意义(P>0.05)。T2、T3、T4不同时相CRP进行双变量相关分析：T2与T3有显著正相关关系(r=0.773,P=0.00),T4与T2无相关关系(P>0.05)。2.3出现粒细胞缺乏症合并发热后第1天(T2)、第3天(T3)与化疗前的基础值(T0)相比,IL-6、IL-8水平变化均有统计学意义(P<0.05),IL-8水平在出现发热后初期开始下降,但IL-6水平发热后即有明显升高,24小时升至最高峰。IL-8和IL-6水平发热后7天(T4)与化疗前的基础值(To)、粒细胞缺乏症合并发热后第1天(T2)、第3天(T3)相比差异均无统计学意义(P>0.05)。2.4T2、T3、T4不同时相IL-6进行双变量相关分析：T2与T3有显著正相关关系(r=0.453,P=0.023),T4与T2有显著正相关关系(r=0.720,P=0.006),T4与T3无相关关系(P=0.54)。2.5T2、T3、T4不同时相IL-8进行双变量相关分析：T2与T3,T4与T2,T4与T3均无相关关系(P>0.05)。2.6IFN-γ发热前后中位水平无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。2.7CRP与IL-6相关关系：粒细胞缺乏症合并发热后第1天(CRP-T2/IL-6-T2)、第3天(CRP-T3/IL-6-T3)、第7天(CRP-T4/IL-6-T4)相比均呈显著正相关关系(P<0.05),相关系数分别为r CRP-T2/IL-6-T2=0.621, r CRP-T3/IL-6-T3=0-805, r CRP-T4/IL-6-T4=0.955。2.8IL-6与IL-8相关关系：粒细胞缺乏症合并发热后第1天(IL-8-T2/IL-6-T2)、第3天(IL-8-T3/IL-6-T3)、第7天(IL-8-T4/IL-6-T4)相比均呈显著正相关关系(P<0.05),相关系数分别为r IL-8-T2/IL-6-T2=0.670,r IL-8-T3/IL-6-T3=0.463,r IL-8-T4/IL-6-T4=0.724。2.9T2、T3和T4时相CRP与IL-8、CRP与IFN-γ、IL-8与IFN-γ、IL-6与IFN-γ均无相关关系(P>0.05)。结论1.1IFN-γ水平可以反映儿童急性白血病化疗前后机体的免疫状态,参与儿童急性白血病化疗后的免疫重建,可以作为监测小儿白血病治疗反应的一个指标,IL-8水平是否参与白血病发病机制有待进一步研究。1.2CRP、IL-8、IL-6可以分别作为儿童白血病出现粒细胞缺乏症合并感染早期诊断的实验室指标之一,CRP、IL-8、IL-6水平的动态变化可以早期诊断感染,发热后第1天与化疗前的基础值相比差异越明显,提示感染越严重、预后差。1.3CRP、IL-6峰值发生在发热后24小时,发热后3天、7天CRP、IL-6水平与峰值有关,峰值越高,下降越慢,可判断抗生素治疗疗效。1.4联合CRP与IL-6、联合IL-6与IL-8作为诊断、判断疗效指标的模型是值得在临床工作中应用。1.5IFN-γ可能在儿童白血病出现粒细胞缺乏症合并感染的过程中所起的作用不大。