芥子气是一种历史悠久的化学战剂,能够引起糜烂性的毒性损伤。自1917年德国率先使用后,各国军队纷纷效仿,在数次战争中造成了严重的军民伤亡。芥子气的化学性质活泼,能够与皮肤、眼和呼吸道等多种组织器官发生反应,引起中毒损伤。皮肤面积大,最先与芥子气接触,是中毒损伤的第一靶器官。芥子气中毒机制复杂,自合成至今尚未完全研究透彻。目前有DNA烃化损伤、PARP激活、炎症反应、谷胱甘肽耗竭、蛋白水解酶激活、细胞凋亡和钙稳态失衡等多种假说,但DNA烃化损伤却被普遍认为是芥子气广泛毒性作用的基础。根据文献报道,芥子气在生物体内经过水解、氧化等作用,会生成多种代谢产物。芥子亚砜作为一种砜类代谢物能够继续氧化生成芥子砜,然而芥子砜的化学性质非常活泼,能够快速转化为二乙烯砜。这些砜类代谢产物毒性作用是什么,是否对DNA具有损伤作用目前均不清楚。目的本课题采用Haca T细胞作为毒性评价模型研究芥子气与二乙烯砜的细胞毒性及DNA损伤毒性,旨在比较芥子气与二乙烯砜的毒性大小并揭示DNA损伤的作用模式,为阐明芥子气的毒性机制及相关防治药物的研究提供实验依据。方法将芥子气配制成6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM染毒液,将二乙烯砜配制成3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM染毒液,采用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测芥子气与二乙烯砜分别染毒24小时Haca T细胞的存活率及LDH漏出率;采用倒置显微镜观察芥子气与二乙烯砜分别染毒24小时Haca T细胞的形态变化;采用Annexin V-FITC试剂盒检测芥子气与二乙烯砜分别染毒24小时Haca T细胞的凋亡指数;采用单细胞凝胶电泳试验评价芥子气与二乙烯砜分别染毒24小时DNA断裂损伤情况;采用荧光定量PCR检测芥子气与二乙烯砜分别染毒6小时、12小时以及24小时同源重组修复RAD51,核苷酸切除修复XPC、XPD,碱基切除修复AAG、APEX1,直接移除修复MGMT、ABH3,和非同源末端连接修复KU70、KU80等基因的表达变化;采用蛋白印记试验检测芥子气与二乙烯砜分别染毒24小时DNA损伤修复相关蛋白γH2AX、PARP、p53和磷酸化p53的表达变化。结果与讨论Haca T细胞毒性试验结果显示,不同浓度的芥子气对Haca T细胞的增殖均有抑制作用,在一定剂量范围内,并呈明显的剂量依赖性,其半数抑制浓度IC50值为121μM;细胞膜的完整性能够影响LDH的漏出,芥子气染毒后,LDH漏出率呈先增加后降低的趋势。在一定剂量范围内,随着染毒浓度的增加,细胞膜受到的损伤越来越严重,导致LDH漏出率逐渐升高;当染毒浓度达到一定剂量时,大量细胞开始死亡,所以LDH漏出率又出现了下降。通过显微镜观察可以发现,随着染毒剂量的增加,细胞皱缩变圆,漂浮的死亡细胞数逐渐增多,观察的结果与CCK-8检测的毒性试验结果较为一致。二乙烯砜细胞毒性结果显示,在0~25μM浓度范围内,随着染毒剂量的增加,细胞存活率逐渐下降,并呈剂量依赖性。但是在25μM至50μM时,CCK-8检测的细胞存活率又出现明显上升,随后在50~400μM剂量范围内,细胞存活率又逐渐下降。观察细胞形态发现,在0~25μM剂量范围内,随着染毒浓度增加,细胞变圆变小,死亡的细胞漂浮在培养液中;但是在50~400μM范围内,镜下观察发现培养液中几乎没有漂浮的死亡细胞,细胞变圆呈贴壁状,并且细胞内有明显空泡。LDH漏出率也呈先增加后降低又上升的趋势。分析原因可能有:1.二乙烯砜作为一种砜类化合物,在一定剂量时,是否与DMSO相似具有维持细胞膜稳定性的作用;2.在0~25μM剂量范围内二乙烯砜与细胞反应的分子机制与50~400μM时二乙烯砜与细胞的反应机制可能不同,在低剂量时,二乙烯砜细胞毒性作用引起细胞膜的破裂,当剂量达到某一阈值时,二乙烯砜起到了类似于固定液的作用,引起细胞死亡,但仍保持细胞膜的完整性。至于具体的毒性作用机制还有待进一步的试验探索。Annexin是一类钙离子依赖的磷脂结合蛋白,主要存在于细胞浆内。细胞在受到损伤发生凋亡或坏死时,细胞膜通常会发生外翻,此时用荧光探针FITC标记的Annexin V则可以直接检测到这一现象。实验结果显示,染毒后芥子气能引起明显的细胞凋亡,并呈剂量依赖关系,在100μM时约有50%的细胞发生凋亡,凋亡结果与CCK-8检测结果相一致。二乙烯砜细胞凋亡实验结果显示,在0~25μM范围内,细胞凋亡率随着染毒剂量的增加逐渐增加,但是从25μM至50μM时细胞凋亡率出现了下降,然后从50~400μM时,细胞凋亡率又逐渐上升,试验结果与CCK-8细胞毒性试验结果相吻合。分析原因可能是因为Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒主要是通过细胞膜外翻以及细胞膜破裂来进行荧光染色,根据前面试验结果显示,在0~25μM范围内,二乙烯砜可能引起细胞膜的破裂,所以凋亡率逐渐上升。但在50μM时,镜下观察发现细胞还保持着较为完整的细胞形态,所以凋亡率出现了下降。单细胞凝胶电泳试验是观察细胞DNA断裂损伤作用的常用方法。结果显示,芥子气与二乙烯砜在低剂量的情况下就能引起明显的DNA断裂损伤,随着染毒剂量的增加,DNA损伤程度逐渐增加,并产生明显的彗星拖尾现象。同时,在相同剂量时,芥子气引起的损伤作用明显大于二乙烯砜引起的损伤作用。结果表明,芥子气与二乙烯砜均能引起DNA的断裂损伤,具有一定的遗传毒性。荧光定量PCR检测DNA损伤修复相关基因的表达。实验结果显示,芥子气染毒24小时后,DNA损伤修复基因均有不同程度的升高,RAD51和ABH3增加最为明显,分别提高了约6倍和5倍,其他基因增加都不超过3倍。12小时时,基因也有不同程度的增加,增加幅度小于24小时。而在6小时时,基因表达基本没有变化。实验结果表明芥子气引起的DNA损伤可能主要由直接移除修复和同源重组修复两种方式进行修复。二乙烯砜实验结果显示,染毒24小时后,DNA损伤修复基因表达出现了明显的下降,12小时也出现了下降,但6小时基本没有变化。分析原因可能是因为芥子气与二乙烯砜和DNA相互作用的毒性原理不同,芥子气的毒性作用原理是取代反应,脱去氯,与DNA亲核位点结合,生成各种水解产物;二乙烯砜主要是发生加成反应,双键断裂,与物质结合,生成各种产物。γH2AX、PARP和p53是细胞内重要的蛋白,在DNA损伤修复过程中发挥重要作用。在本研究中,采用Western blot检测这些蛋白的表达。实验结果显示,芥子气染毒24小时后,随着染毒剂量的增加,γH2AX蛋白表达量有略微增加,PARP 116k D整体蛋白表达呈逐渐降低的趋势,p53和磷酸化p53呈先升高后降低的趋势。说明在芥子气引起DNA损伤后,在低剂量范围内,p53和PARP主要起修复作用,促进细胞生存;当染毒剂量升高后,细胞受到严重损伤,并且难以被修复时,p53和PARP主要起促凋亡作用,引起细胞死亡。二乙烯砜染毒24小时后,γH2AX和PARP蛋白表达量基本没有变化,p53蛋白随着剂量的增加先升高后降低,而磷酸化p53则没有检测到。细胞DNA损伤修复过程是一个复杂的通路体系,是由多种蛋白、多条通路共同作用的结果,所以要想完全揭示芥子气与二乙烯砜DNA损伤修复过程还需进一步的深入研究。结论通过本实验的研究,我们得出以下结论:芥子气与二乙烯砜对Haca T细胞具有明显的细胞毒性作用,能够引起细胞凋亡;二乙烯砜的细胞毒性作用大于芥子气。芥子气与二乙烯砜都具有一定的遗传毒性,能引起DNA的断裂损伤,芥子气的DNA毒性作用大于二乙烯砜。芥子气引起的Haca T细胞DNA损伤可能主要由同源重组修复和直接移除修复两种方式进行修复,而二乙烯砜相关修复基因的表达量却是不断降低。γH2AX、PARP和p53参与了芥子气引起的DNA损伤修复过程,而二乙烯砜没有观察到明显的变化。