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厌氧病原体艰难梭菌(Clostridium difficile)能够直接感染人类导致结肠炎和结肠癌(简称为CDI),在北美和欧洲发现较多,发病率和死亡率较严重,目前在中国也已有报道。由于该病原体极度厌氧,对研究和疾病防治带来较大困难。 艰难梭菌基因组测序结果表明:该病原体基因组中存在乙酰辅酶A合成通路(Wood-Liungdah通路)中所有相关同源蛋白,主要包括甲基转移酶、钴铁硫蛋白、乙酰辅酶A合成酶和一氧化碳脱氢酶等。该通路是许多厌氧微生物中重要的能源和物质代谢通路之一,并且不存在于人体中。因此,这些蛋白(酶)有可能成为治疗Clostridium dufficile所引发疾病的潜在药物靶点。本文研究的主要目的是为病原体中该通路的后续详细研究奠定基础,并为相关药物的开发提供设计思路。 本文研究了病原体C.difficile630的乙酰辅酶A通路中的四种关键酶(蛋白),包括甲基转移酶(MeTrcd,268个氨基酸)、钴铁硫蛋白(CoFeSPCd,包括两个亚基delta和gamma,分别含314个氨基酸和455个氨基酸)、乙酰辅酶A合成酶(ACSCd,708个氨基酸)和一氧化碳脱氢酶(CODHCd,639个氨基酸)。 首先,我们研究了病原体C.difficile630中编号为CD0727的甲基转移酶基因(MeTrCd),包括基因克隆、重组表达与纯化,成功建立了高效大肠杆菌表达纯化体系(蛋白产量可达50 mg每升TB培养基);使用圆二色光谱对其二级结构进行了表征;通过序列和结构分析及生物信息学,得到了其同源模拟结构。 研究了病原体C.difficile630中编号为CD0725和CD0726(分别编码钴铁硫蛋白gamma和delta亚基)的基因,通过基因克隆、重组表达与纯化研究,成功建立了一套较为高效的重组表达体系;对CoFeSPCd的金属中心Fe4S4和钴胺素的化学重组进行了研究,并运用紫外可见光谱对其进行表征,实验结果表明我们通过重组得到的CoFeSPcd是具有完整金属中心的全蛋白。 通过色氨酸荧光淬灭光谱测定了甲基四氢叶酸的底物结合常数,及其随pH值减小的构象变化现象。实验结果表明MeTrCd的底物结合能力与同源蛋白MeTrMt(来源于嗜热菌Moorella therrnoaceticum的MeTr)相比有显著下降。该差异可能是由MeTrCd中底物结合位点腔His11的存在造成的。色氨酸荧光淬灭光谱实验表明MeTrod存在pH依赖性的构象变化性质。该变化导致蛋白疏水区域的色氨酸残基溶剂暴露程度加大,从而有利于底物结合及完成催化功能。 通过厌氧条件下的截流光谱技术详细研究了MeTrCd的甲基转移反应动力学,得到了。MeTrcd与外源性CoFeSPMt(来源于嗜热菌Moorella thermoaceticum的CoFeSP)和钴铵素反应的米式方程动力学参数。通过厌氧条件下的截流光谱技术检测了CoFeSPcd接受甲基的功能,并通过改变CoFeSPcd的浓度得到了以CoFeSPcd为底物的MeTrcd催化甲基动力学常数。研究发现分别使用CoFeSPMt、钴铵素和CoFeSPcd作为催化底物,无论是催化速率常数(Kcat)还是催化效率(Kcat/Km)都遵循这样一个规律:CoFeSPMt＜CoFeSPcd＜钴胺素。该规律进一步验证了我们的推论即当使用MeTrcd-CoFeSPcd同源反应体系时,其相互作用的增强有利于甲基转移反应的完成。采用计算机模拟分子对接研究对MeTr和CoFeSP的相互作用进行了研究,结果表明MeTr和CoFeSP相互作用有可能采取侧面进攻(Conform3)的方式完成,并且CoFeSPcd与MeTrcd相互作用时的交界面处氨基酸的盐桥、氢键等起了重要的稳定作用。 本文详细研究了乙酰辅酶A合成酶。首次建立了病原体C.difficile630乙酰辅酶A合成酶(ACScd)的大肠杆菌体外重组表达纯化体系;通过金属含量分析、紫外可见光谱以及EXAFS等光谱研究表明ACSCd在结构上具有ACSMt(来源于嗜热菌Moorella thermoaceticum的ACS)的典型金属活性中心A-cluster;活性测定实验表明ACSCd的乙酰辅酶A合成活性速率常数为0.04μmin-1mg-1、甲基转移酶活性速率常数为0.26±0.05 min-1;对ACSCd的抑制剂进行了初步的研究,并发现三种抑制剂均能有效抑制其活性;离体抑菌活性研究进一步验证了它们对病原体C.difficile的抑制效果。这一研究具有十分重大的理论意义和应用价值,有可能成为寻找治疗CDI疾病药物的一个新策略。 此外,我们对一氧化碳脱氢酶的基因克隆、蛋白质重组表达纯化进行了初步的研究探索。一氧化碳脱氢酶(CODH)的功能是催化CO和CO2的可逆氧化还原,它是乙酰辅酶A通路中的重要金属酶之一,但是该蛋白很容易以包涵体沉淀的形式存在,人们一直未能建立该蛋白的大肠杆菌表达体系。本文通过构建多个原核表达质粒,对嗜热菌Moorella thermoacetica的CODHMt以及病原体CODHCd的重组表达纯化进行了一系列的探索,我们得到了含有麦芽糖融合标签的蛋白。这一研究为将来详细研究CODH的结构与功能奠定了基础。 总之,本文对艰难梭菌(Clostridium difficile)乙酰辅酶A合成通路中的四种关键酶(蛋白)进行了基因构建、重组表达与纯化的研究探索,成功得到了其中3种酶(蛋白)的高效表达纯化体系,并进行了详细的结构、功能与性质及抑制剂的研究。该研究不仅增进了人们对该病原体的认识和对乙酰辅酶A合成通路的了解、而且为开发新型治疗CDI药物提供了理论依据和思路。