论文部分内容阅读
钙霉素（Calcimycin）是一类含有吡咯环的聚醚类抗生素，广泛用于细胞二价阳离子的生物学功能研究。化学结构包括三部分：吡咯环、螺旋环及含有取代基团的苯丙噁唑环。分子内部并列排列着许多氧原子而带负电，外部由疏水烃类构成，因此钙霉素作为一种二价阳离子载体嵌入膜内进行细胞膜内外钠钾等离子的运输并且可以特异螯合二价金属阳离子（Ca2+、Mg2+），被广泛应用于二价阳离子穿膜时生物属性的研究，另外，钙霉素还具有抗真菌、抗部分革兰氏阳性菌、诱导细胞凋亡等生物活性，同时它可以抑制ATPase活性从而抑制ATP的水解，同时还是哺乳动物细胞氧化磷酸化的一种解偶联剂。因此钙霉素在生物基础研究和应用研究领域具有重要价值。自钙霉素发现以来，已有16,000多篇文献对其进行报道。 Streptomyces chartreusis NRRL3882为钙霉素产生菌。前期用同位素标记的脯氨酸、乙酸、甲酸、3-羟基邻氨基苯甲酸和甲硫氨酸进行喂养实验,揭示了钙霉素骨架结构的生物合成前体来源。钙霉素的生物合成基因簇于2011年被成功克隆。钙霉素的整个生物合成途径已经成功得到推导，部分基因功能已得到确定。 为确认功能未知基因calD，预将基因calD克隆到钙霉素产生自身菌教酒链霉菌NRRL3882中，同时引入Flag标签以便下游的蛋白纯化。HPLC检测分析回补菌株、野生菌株和突变菌株的发酵产物，回补菌株恢复了钙霉素产生能力，确定calD基因回补成功，同时说明Flag标签的引入不会影响教酒链霉菌中钙霉素的合成。从钙霉素表达量、菌体量和菌体破碎难易程度三个方面在发酵培养基和发酵时间两个参数上进行条件优化，以期提高目的蛋白得率。最终确定最佳发酵培养基为YEME培养基，最佳发酵时间为10天，并进行后续的大规模发酵工作。Western blotting实验确认Flag标签融合蛋白CalD-Cflag在链霉菌中的成功表达，生物信息学预测CalD蛋白属于氧化还原酶超家族，HPLC结果显现calD基因的缺失导致突变株钙霉素产生能力大大低于野生菌株，高分辨质谱和二级质谱结果显示突变株中积累了多于野生菌株的3-Hydroxylcezomycin，因此calD基因的缺失阻断了3-Hydroxylcezomycin的大部分转变，导致突变株内3-Hydroxylcezomycin的积累。生物信息学预测CalD蛋白属于氧化还原酶家族，因此推测CalD蛋白酶可能负责催化苯丙噁唑环上3’羟基的氧化，氧化产物可能为酮基化合物，即3-Ketocezomycin。 从钙霉素基因簇上克隆到聚酮合酶（PKS）基因：calA1、calA2、calA3、calA4、calA5，构建了九种重组病毒：AcNPV-CalA1，AcNPV-CalA2,AcNPV-CalA3,AcNPV-CalA4,AcNPV-C5,AcNPV-CalA1 His,AcNPV-CalA2StrepII,AcNPV-CalA3StrepIII，AcNPV-CalA4Flag。杆状病毒表达系统表达蛋白，亲和层析尝试小体积蛋白纯化，并得到部分聚酮合酶蛋白，证明了昆虫细胞-杆状病毒系统表达聚酮合酶的可行性。