酶解马氏珍珠贝蛋白制备ACE抑制肽的研究

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马氏珍珠贝(Pinctada martensii)是我国海水养殖的重要经济贝类之一。马氏珍珠贝肉中富含酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸。通过选取马氏珍珠贝肉中30个(大多是表达于肌肉组织中)已知的蛋白片段,将其与已知的ACE抑制肽段进行比对,发现一些蛋白序列中富含有ACE抑制肽的肽段,这些肽段是以二肽、三肽等为主的短肽。对高效液相色谱测定血管紧张素转化酶(ACE)抑制率的方法的流动相、加样量、加样浓度、终止反应酸量、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)与ACE加入顺序的条件进行摸索,确定最优的条件为:流动相采用乙腈:水为25:75(v/v),水中含三氟乙酸0.05%;加样浓度与加样量为:总反应液为130μL,由30μL的HHL(5mmol/L)、10μL的酶解液、30μL的ACE溶液(100mU/mL),和10μL的盐酸(HCl)(100mmol/L)组成;采用先加入HHL的加入顺序作为测定ACE抑制率的方法;通过扣除样品产生的干扰峰的影响,优化了原有的高效液相色谱测定ACE抑制率方法。以ACE抑制率、蛋白质回收率、水解度为指标比较了四种商业酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶)和自制酶对马氏珍珠贝肉的酶解效果,从中筛选出复合蛋白酶、胃蛋白酶、自制酶做进一步研究,通过正交实验确定ACE抑制率最优的酶解液的制备方案是采用胃蛋白酶,酶解条件是:酶解温度为37℃,酶解pH3、酶解时间为35h。将ACE抑制率最优的酶解液进行模拟胃肠道消化实验,结果发现酶解液经过胃蛋白酶处理2h之后ACE抑制率增加至65.64%,经过胰酶处理2h后,其ACE抑制率降低至52.57%。由于其ACE抑制率在整个模拟胃肠道消化过程前后变化较小,因此说明其经胃肠道消化酶系的作用后,ACE抑制率可以保持相对的稳定。
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