【摘 要】
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目的:CD6分子是一种主要表达在T细胞和部分B细胞表面的糖蛋白,参与调节淋巴细胞发育、选择、激活和分化。两种已知的哺乳动物CD6分子配体CD166和最近发现的CDCP1广泛表达于免疫细胞和其他多种细胞类型,包括上皮细胞、间充质细胞和肿瘤细胞。越来越多的证据显示CD6及其配体在诸如多发性硬化、银屑病等免疫相关疾病的病理生理过程中发挥作用,同时也可作为潜在的治疗靶点。已有多项研究提示除CD166和CD
【基金项目】
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国家自然科学基金（81970402,81800407）； 主持国家自然科学基金青年项目,项目批准号:81600602,项目名称:FOXP3乙酰化修饰异常对桥本氏甲状腺炎中CD4+CD25+Treg的影响及其机制研究;项目起止年月:2017年1月至2019年12月； 国家建设高水平大学公派研究生项目,项目批准号:201808
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目的:CD6分子是一种主要表达在T细胞和部分B细胞表面的糖蛋白,参与调节淋巴细胞发育、选择、激活和分化。两种已知的哺乳动物CD6分子配体CD166和最近发现的CDCP1广泛表达于免疫细胞和其他多种细胞类型,包括上皮细胞、间充质细胞和肿瘤细胞。越来越多的证据显示CD6及其配体在诸如多发性硬化、银屑病等免疫相关疾病的病理生理过程中发挥作用,同时也可作为潜在的治疗靶点。已有多项研究提示除CD166和CDCP1外仍存在CD6分子的未知受体;CDCP1在被证实是CD6配体之后提示其可能存在免疫调节功能,但相关领域目前鲜有研究报道。本研究拟利用邻近蛋白生物素标记法寻找CD6分子除CD166和CDCP1外新的配体以及CDCP1在白色念珠菌水溶物（candida albicans water soluble fraction,CAWS）诱导的小鼠川崎病（Kawasaki disease,KW）动脉炎模型的作用和相关机制。研究方法:利用SPPLAT邻近蛋白生物素化标记法标记h TERT RPE细胞表面CD6分子的邻近蛋白,裂解细胞后利用Streptavidin磁珠分离纯化生物素标记蛋白,之后利用质谱分析对标记的蛋白进行鉴定,筛选CD6潜在受体。对筛选出的潜在受体利用双抗体夹心ELISA、免疫沉淀、竞争性抑制以及表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）进行验证。最后利用新受体的特异性si RNA将该受体蛋白敲低,从功能方面证实CD6与新受体的相互作用。研究的第二部分利用C57BL/6J野生型小鼠和CDCP1-/-小鼠构建CAWS诱导的川崎病动脉炎模型,评估敲除CDCP1对模型动脉炎形成、炎症因子表达、脾肿大、脾脏及外周血细胞成分构成等表型方面的影响。利用免疫荧光以及Western Blot检测小鼠不同组织器官中CDCP1的表达情况。分离培养小鼠心脏成纤维细胞和骨髓来源树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）,研究CAWS刺激对上述细胞CDCP1表达和炎症因子分泌的影响。最后利用Western Blot检测敲除CDCP1后对CAWS刺激的小鼠BMDCs中Dectin-2信号通路的影响。结果:h TERT RPE细胞表达CD6已知的两种配体CD166与CDCP1,且无内源性CD6表达;重组人CD6分子可与h TERT RPE细胞特异性结合,且CD44是重组人CD6结合到h TERT RPE细胞表面的邻近蛋白;ELISA以及SPR实验证实重组人CD44可与重组人CD6直接结合;重组人CD44可沉淀细胞蛋白裂解液中的CD6,反之亦然;CD44配体透明质酸可竞争性抑制重组人CD44沉淀细胞蛋白裂解液中的CD6;重组人CD6与h TERT RPE细胞表面的结合可被重组人CD44竞争性抑制;重组人CD6与h TERT RPE细胞特异性结合引起h TERT RPE细胞表面CD166、CDCP1和CD44分子聚集成簇,同时引起细胞骨架重塑;利用si RNA敲低CD44分子表达后,细胞骨架重塑改变受到抑制。利用野生型和CDCP1基因敲除小鼠腹腔注射CAWS构建川崎病动脉炎模型,发现CDCP1-/-小鼠表现出明显较轻的心脏炎症反应和血清抗体水平;CDCP1-/-小鼠在注射CAWS后28天血清IL-6水平显著低于野生型小鼠;机制研究发现BMDCs表达并可在CAWS的刺激下诱导合成CDCP1;敲除CDCP1的BMDCs在CAWS诱导下分泌IL-6的能力明显减弱,且该过程与Syk-MAPK信号通路相关。结论:CD44是除CD166和CDCP1之外CD6分子的第三种配体,CD6与CD44相互作用可引起细胞骨架重塑。CDCP1可通过Syk-MAPK信号通路影响DCs分泌IL-6,进而影响CAWS诱导的小鼠川崎病动脉炎模型的发展,提示CDCP1和IL-6是KW治疗的潜在靶点。
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