番茄再生体系和转化体系的优化研究

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本研究以“中蔬四号”番茄品种为试验材料,采用组织培养方法优化了不定芽的再生体系;采用携带双元表达载体pBI121(含GUS基因和NPTⅡ基因)的农杆菌EHA105侵染番茄子叶,筛选出了适宜的转化条件,为以后采用基因工程技术改良番茄性状奠定了基础。具体研究结果如下:1、以番茄无菌苗子叶为外植体,在培养基MS上添加不同有机物和不同浓度ZT和IAA诱导番茄愈伤组织和不定芽,结果表明,番茄子叶再生的最佳培养基为MS(添加0.07%MES)+2mg/L ZT+0.1mg/L IAA。比较子叶、真叶和下胚轴不同部位的再生情况的结果表明,子叶中间段为最佳外植体,诱芽频率高达98.3%,真叶次之,下胚轴的诱芽率最低。在继代培养中最有利于再生芽伸长的培养基组合为MS+1mg/L ZT+1mg/LGA。不定芽生根的最佳培养基为1/2MS+0.3mg/L IAA,生根数较多,且根较粗壮。2、农杆菌经活化后,将菌液在含有不同浓度的头孢霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和利福平的YEB固体培养基上划线培养,来测定农杆菌的抗性。结果表明,菌株EHA105对卡那霉素、利福平、和链霉素有一定的抗性,而头孢霉素、氨苄青霉素抑制了该农杆菌的生长;另将活化好的菌液加入到YEB液体培养基进行振荡培养来测定菌株的生长曲线,结果表明,菌液振荡培养20h进入对数生长期,28h后进入稳定生长期,培养时间在24h~28h间的菌株活性高,适用于侵染外植体。3、在番茄对抗生素的敏感性试验中,抑菌抗生素头孢霉素的最佳浓度为400mg/L,选择抗生素卡那霉素的最佳浓度为50mg/L。以番茄子叶为外植体,采用含pBI121质粒的根癌农杆菌EHA105介导的方法研究了番茄遗传转化的相关因素。结果表明,外植体预培养2d,GUS染色效果最好,抗性芽诱导率最高为22.75%;在诱导和共培养基中都加入200~300μmol/L乙酰丁香酮时,GUS染色效果和抗性芽诱导率均优于其他组合;菌液OD600值为0.6时,外植体生长良好,GUS染色效果最佳,抗性芽诱导率最高为25.16%;最有利于抗性芽诱导的农杆菌侵染时间和共培养时间分别以5min和2d为宜。通过抗性植株的PCR检测,确定目的基因已整合到番茄基因组中,这为今后番茄的遗传转化奠定基础。
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